药物检验工-12高效液相色谱法ppt课件.ppt

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1、液相色谱法液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀常压下输送流动相柱效较低分析周期长现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀高压下输送流动相柱效较高分析周期短1经典液相色谱包括：柱色谱和平面色谱高效液相色谱法HPLC第一节概述highperformanceliquidchromatography以气相色谱理论为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm

2、且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测，灵敏度差2．HPLC：分离和分析柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测，灵敏度高二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、热稳定性差、离子型等样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差

3、及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装

4、置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置固定相和流动相1、固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷键合硅胶（C18，ODS柱——HPLC约80%问题）2、流动相：流动相极性>固定相极性底剂（水）+与水混溶的极性调节剂常用甲醇－水、乙腈－水等3、分离机理：疏溶剂理论为代表(了解)溶质的保留机理是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力流动相洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）——类似GC的等温度洗脱；以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个

5、泵）具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求2）梯度洗脱：——类似GC的程序升温在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵）。适于分析极性差别较大的复杂组分缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度有时引起基线漂移、重复性较差峰的鉴别：1．苯；2．氯苯；3．对二氯苯4．1，2，3三氯苯；5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脱两种洗

6、脱方式的比较（b）等度洗脱7/28/2021溶剂系统选择的一般原则RBPC流动相极性越强，洗脱能力越弱。（1）溶剂种类：水+甲醇、水+乙腈（2）溶剂比例：水的比例增加，使k增大（3）溶剂pH：影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂（色谱纯）作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相的pH介于2~

7、8一、输液系统高压输液泵恒压泵：流量精度不稳恒流泵（常用）：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式高效液相色谱仪输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。

8、进样阀二、进样系统三、分离系统色谱柱（column）由柱管（不锈钢管）和固定相组成分析柱（直径4~6mm如4.6mm，柱长10~30cm）、制备柱柱效评价：色谱系统适应性试验R≥1.5，n（符合规定），fs（0.95~1.05）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗（了解）保护柱一般在分析柱前装上