反相高效液相色谱法测定肝脏维生素A.docx

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1、反相高效液相色谱法（HPLC）分析小鼠血清和组织中的视黄醇以及视黄基酯1.材料1.1。标准品的准备1.乙醇（ACS级）。2.视黄醇（Sigma）。3.视黄酯（Sigma）。4.维生素A棕榈酸酯（Sigma）。5.带帽棕色试剂瓶1.2。视黄醇的提取1.新鲜或冷冻的血清或组织（全部样品解剖后立即在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃。如果可能的话，从血清和组织萃取视黄醇必须“在黑暗中”迅速地进行，所有的提取步骤应在冰上或在冷室中进行。实验室窗户应覆盖合适的材料，如铝箔或厚重的窗帘（没有窗户的房间，是执行此过程的理想场所）。人工照明应在零售商店买黄色灯泡。另外，使用昏暗的灯光下，不要把样

2、品直接暴露在灯光下，尽量减少光敏感视黄醇损失）。2.使用内标法所需要的内标物（视黄醇乙酸酯）。3.乙醇（ACS级）。4.己烷（HPLC级）。5.H2O（HPLC级）。6.PVDF过滤膜即聚偏二氟乙烯膜（0.22微米，47毫米）。7.全玻璃过滤装置。8.磷酸盐缓冲盐水（PBS），仅用于组织。9.N2气体，Evap-O-Rac系统（科尔-帕默）。10.PRO200手持式均质匀浆器，仅用于组织。11.巴斯德玻璃移液管（9英寸）和洗耳球。12.聚丙烯管（12毫米×75毫米）。13.玻璃试管（13毫米×100毫米16毫米×100毫米）。1.3。视黄醇的分析1.高效液相色谱法系统（本章中所

3、提到的HPLC配件如棕色小瓶，进样瓶，瓶帽与戴安终极版3000系列高效液相色谱仪兼容。不同的HPLC系统可能还需要其他一些类型的配件）2．色谱柱（在我们的实验中，随着时间的推移，这个贝克曼色谱柱显示的结果具有重复性（包括保留期））3.保护柱4.棕色试剂瓶（本章中所提到的HPLC配件如棕色小瓶，进样瓶，瓶帽与戴安终极版3000系列高效液相色谱仪兼容。不同的HPLC系统可能还需要其他一些类型的配件）5.自动进样瓶（这个玻璃插入物通过一个弹簧塞进瓶里，弹簧对接触尖状物起缓冲作用。一旦完成样品的分析后，我们应该好好保存弹簧便于以后组装新的小瓶。）6.带有瓶盖的PTFE/硅隔膜（这些瓶盖

4、和隔垫，可单独购买，(capw/osepta,NationalScientific,cat.no.C4000-98BLK;septa,NationalScientific,cat.no.C4000-60).）7.甲醇（HPLC级）。8.乙腈（HPLC级）。9.二氯甲烷（HPLC级）。2方法由于视黄醇的光敏性质，所有以下实验程序应该“在黑暗中”执行。（从血清和组织萃取视黄醇必须“在黑暗中”迅速地进行，所有的提取步骤应在冰上或在冷室中进行。实验室窗户应覆盖合适的材料，如铝箔或厚重的窗帘（没有窗户的房间，是执行此过程的理想场所）。人工照明应在零售商店买黄色灯泡。另外，使用昏暗的灯光下

5、，不要把样品直接暴露在灯光下）2.1标准品的准备1.制备标准品储备溶液是将标准品溶解到适当的溶剂中，如下：乙醇溶解视黄醇及视黄醇酯;正己烷溶解维生素A棕榈酸酯。2.标准品储备液应该在棕色试剂瓶内制备并保存在-20°C。（高度浓缩的类视黄醇标准储备液即使储存在-20℃也会随时间降解。储备液推荐的最佳浓度约为1毫克/毫升。30毫升为原液的建议体积。根据上述方案制备储备液，在-20℃下，可以保持数月。）3.稀释每个标准溶液到约1纳克/微升。（稀释后的标准液都应保存在棕色小瓶。我们建议将稀释后的标准溶液分为小等分，每份3-4毫升。可以通过在盖上帽之前，用N2气体冲洗小瓶的顶部空间使降解

6、或化合物的损失最小化。在用HPLC分析等分的稀释后的标准试样之前，要检查其质量）4.用分光光度计测量稀释后的标准溶液，吸光度为325纳米（使用1厘米宽的石英比色杯（1毫升））5.根据OD值和具体的消光系数计算各标准溶液的浓度（消光系数取决于该化合物和溶解的溶剂。视黄基醋酸酯溶解在乙醇中的消光系数是1550，视黄醇溶解在乙醇是1835，而维生素A棕榈酸酯溶解在乙醇是975）。6把稀释后的标准溶液分装在棕色小瓶中，并将它们储藏在-20℃下（稀释后的标准液都应保存在棕色小瓶。我们建议将稀释后的标准溶液分为小等分，每份3-4毫升。可以通过在盖上帽之前，用N2气体冲洗小瓶的顶部空间使降解

7、或化合物的损失最小化。在用HPLC分析等分的稀释后的标准试样之前，要检查其质量）2．2。校准曲线的确定2.2.1。检测限度1.准备一系列不同稀释度的标准液（视黄醇，视黄酯，以及维生素A棕榈酸酯）。（检出限取决于探测器和色谱柱的使用情况。浓度范围的选择应根据所分析的组织的类视黄醇的含量。参见图15.1a为检测限曲线的一个典型的例子）2.将稀释液注入到HPLC柱。（如何操作HPLC系统将取决于仪器的类型，此程序的介绍对实验并没有什么作用。我们只建议监测色谱柱的压力和加样前目标波长的基线。各稀释样