实验5PCR扩增目的片段.docx

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1、实验五、PCR扩增目的片段【实验目的】熟练掌握利用PCR扩增仪对DNA的扩增【实验原理】PCR类似于DNA的天然复制过程。PCR技术实际上是一个在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。整个扩增过程分为三步：①变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火：突然降温后，模板DNA与引物按碱基配对的原则互补结合。也存在2链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要结合发生在模板与引物之间；③延

2、伸：在DNA聚合酶及镁离子存在时，从引物的3`端开始、结合单核苷酸，形成与模板互补的新的DNA链。上述三步为一个循环，理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为下一轮模板链循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。【试剂和器材】基因组DNA；10´PCR反应缓冲液、4´dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物（P1、P2）、超纯水；PCR反应管、移液器、PCR仪、离心机。【实验步骤】1、引物设计利用引物设计软件（PrimerPremi

3、er5）对扩增的片段进行引物设计同时合成引物上游引物：5'GCATCCGTCGCTCTTCTCGT3'下游引物：5'AGGGCAGTCTCAAGGTGTTCC3'2、准备PCR反应溶液10µl体系：ddH2O：4.9µlTaq聚合酶：0.1µl上游引物：1µl下游引物：1µldNTP1µl模板：1µl扩增缓冲液1µl总体积：10µl3、PCR扩增反应（循环数25）PCR程序：1,94℃2min2c，94℃30s3c,55℃30s4c,72℃1min5,72℃10min6,16℃----【实验结果

4、】1、电泳结束后，将琼脂糖凝胶置凝胶分析仪中，在紫外灯下观察PCR产物的电泳位置。2、与DNAmarker对照，准确描述目标产物的bp数。