实验四PCR扩增基因特异片段.doc

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1、实验四PCR扩增基因特异片段一、实验目的1、学会PCR仪的使用方法。2、掌握PCR反应的实验技术。二、实验原理聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技

2、术。GLBI蛋白是玉米胚中含量最丰富的蛋白质之一，其编码基因glb1位于第一染色体长臂，基因表达仅限于种子组织。该蛋白对于幼苗生长与存活并非必需。本实验扩增glb1基因部分序列，全长1200bp左右。真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。其中18S、5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守,适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析,其间的间隔区为内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)，本

3、实验扩增榨菜黑斑病ITS序列，序列全长500kb左右。三、实验仪器及药品耗材1、主要仪器：移液器、振荡器、PCR仪、电子天平、量筒、微波炉、电泳仪、水平电泳槽和凝胶成像系统等。2、主要药品及耗材：一次性手套、PCR板、移液器吸头、无菌水、2×PCR混合酶（TaqDNAPolymerase、PCRBuffer、Mg2+、dNTPs及PCR稳定剂和增强剂组成的混合液）、液体石蜡、琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、Goldview染料、DNAMarker2000和溴酚蓝等。四、实验步骤（一）PCR扩增玉米目的基因glb11、在PCR管中配制25ul反应体系双蒸水8.5u

4、l2×PCR混合酶12.5ul正向引物1ul反向引物1ulDNA2ul液体石蜡20ul2、按一下程序进行扩增94℃预变性5min，1个循环；94℃变性1min，64℃退火1min，72℃延伸2min，共设35个循环；72℃延伸10min；4℃保存(二)琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果配制1%琼脂糖凝胶，在25ulPCR扩增产物加1ul溴酚蓝，200伏，200毫安，电泳并观察结果。三、作业绘画出PCR扩增电泳图，标明DNAMarker位置及检测PCR产物位置，并根据DNAMarker位置及亮度估算PCR扩增产物的大小及浓度。