荧光定量操作不同仪器.doc

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1、SYBR® PremixExTaq™ II(TliRNaseHPlus) 应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem II 扩增仪的操作方法 1.按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度 SYBR® PremixExTaq II（TliRNaseHPlus）（2×）12.5μl  1×   PCRForwardPrimer（10μM）1μl  0.4μM*1   PCRReversePrimer（10μM）1μl  0.4μM*1   DNA模板（<100ng）*22μl    dH2O（灭菌蒸馏水）8.5μl    Tota

2、l25μl*3   *1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0μM范围内调整引物浓度。*2在25μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*3建议反应液体积为25μl。 2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以

3、尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。两步法PCR扩增标准程序：Hold  (预变性) Cycle:1 95℃  30秒 PCR反应*4 Cycle:40 95℃  5秒 60℃  30-60秒 Dissociation *4：PCR的最适反应条件请参考「实验条件的选择」 ◆特别提示： 本制品中使用的TaKaRaExTaq HS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PC

4、R的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。 3.实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。