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时间:2020-09-12
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1、SYBR® PremixExTaq™ II(TliRNaseHPlus) 应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem II 扩增仪的操作方法 1.按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。试剂使用量终浓度 SYBR® PremixExTaq II(TliRNaseHPlus)(2×)12.5μl 1× PCRForwardPrimer(10μM)1μl 0.4μM*1 PCRReversePrimer(10μM)1μl 0.4μM*1 DNA模板(<100ng)*22μl dH2O(灭菌蒸馏水)8.5μl Tota
2、l25μl*3 *1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在0.1-1.0μM范围内调整引物浓度。*2在25μl的反应体系中,DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同,必要时可进行梯度稀释,确定最佳的DNA模板添加量。另外,2StepRT-PCR反应的cDNA(RT反应液)作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*3建议反应液体积为25μl。 2.进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因,两步法PCR反应扩增性能较差时,可以
3、尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。两步法PCR扩增标准程序:Hold (预变性) Cycle:1 95℃ 30秒 PCR反应*4 Cycle:40 95℃ 5秒 60℃ 30-60秒 Dissociation *4:PCR的最适反应条件请参考「实验条件的选择」 ◆特别提示: 本制品中使用的TaKaRaExTaq HS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶,与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比,不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长,会使酶的活性下降,其PC
4、R的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性,通常设定为95℃、30秒。 3.实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器操作手册。
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