荧光定量PCR操作流程.doc

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1、荧光定量PCR操作流程1.目的基因引物的合成设计合成200-300bp目的基因片段的引物，利用primer5.0引物设计工具或者手工合成，引物合成过程中注意上下游的Tm值要相似、GC碱基在上下游的引物里均匀、引物与模板序列紧密互补、引物间避免形成稳定的二聚体或发夹结构等事项。2总RNA提取（1）准备研钵（灭菌）、离心管（1.5ML），枪头、手套（一次性）、异丙醇、乙醇，三氯甲烷2）取适量家蚕组织，加液氮充分研磨；匀浆加1mlRNAisoPlus后匀浆；3）室温放置5min（可在-70℃下保存1个月）4）加0.2ml氯仿（chloroform），振荡混匀，室温放置5分钟；5）12000g

2、，15min，4℃；6）取上清（约0.6ml），加与上清等体积异丙醇，室温放置10分钟；7）12000g，10min，4℃；8）取沉淀（RNA呈胶状沉淀），加1ml75%乙醇（可在-20℃保存1年）洗涤；9）12000g，5min，4℃；10）取沉淀，室温干燥10min；11）溶解于DEPC处理水中12）-80℃保存，尽快使用，或在8）保存。3反转录（TOYOBO试剂盒）Nuclease-freewaterupto10ul5ⅹRTbuffer2ulRTEnzymeMix0.5ulPrimerMix0.5ulRNA0.5-1ug10ul37℃水浴15min98℃，5min水浴使酶失活反应

3、结束，保存于4℃或者-20℃条件下备用（一般定量PCR时稀释20倍）4定量PCR反应（本实验室7300系统）SYBR10ulForwardPrimer1ulReversePrimer1ulROXⅠ0.4ulcDNA模板2uldH2O5.6ul20ul一个模板重复三次以尽量减小误差；每个模板都要设内参。内参是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。而后按照试剂盒说明操作流程设定仪器参数即可。