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1、实时荧光定量PCR原理与实验设计林天时王秋泉FieldApplicationScientist4008208982/8008208982-2-3cnmcbsupport@lifetech.comLifeTechnologies™Proprietary
2、1实时荧光定量PCR技术原理LifeTechnologies™Proprietary
3、2什么是实时荧光定量PCR?•一种实时监控核酸扩增的技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。LifeTechnologies
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5、3定量PCR如何工作?•PCR反应液加入了各种类型的荧光标记物一个PCR循环LifeTechnologies™Proprietary
6、4定量PCR如何工作?•在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强PCRPCRPCR产物大量PCR产物LifeTechnologies™Proprietary
7、5定量PCR如何工作?无论是哪个型号,所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分2.光源3.检测器1.热循环模块LifeTechnologies™Proprietary
8、6定量PCR如何工作?•每个循环结
9、束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加循环1滤光片A样品1Level:LifeTechnologies™Proprietary
10、7定量PCR如何工作?最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析LifeTechnologies™Proprietary
11、8定量PCR的数学原理LifeTechnologies™Proprietary
12、9PCR动力学曲线和四个阶段平台期线性增长期指数增长期基线期对数图谱线性图谱LifeTechnologies™Proprietary
13、10指数增长期内扩增曲线具有高度重复性96次重
14、复可变的平台期荧光信号指数增长期内重复性好循环数LifeTechnologies™Proprietary
15、11定量PCR扩增曲线的各种概念Ct值n∆R阈值线基线CyclesLifeTechnologies™Proprietary
16、12什么是基线？•基线是扩增曲线的水平部分基线基线对数图谱线性图谱LifeTechnologies™Proprietary
17、13什么是阈值？•阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线阈值阈值线阈值阈值线对数图谱线性图谱LifeTechnologies™Proprietary
18、14什么是
19、Ct值？•Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值CtCt对数图谱线性图谱LifeTechnologies™Proprietary
20、15如何计算结果?绝对定量相对定量Ctvalues01234567LogcopynumberLifeTechnologies™Proprietary
21、16定量PCR的化学原理LifeTechnologies™Proprietary
22、17两种化学方法TaqMan探针法染料法LifeTechnologies™Proprietary
23、18TaqMan探针法•TaqMan水解探针：5′端荧光报告基团
24、与靶基因特异性结合的序列3′端荧光淬灭基团报告基团淬灭基团LifeTechnologies™Proprietary
25、19TaqMan水解探针作用机理•完整的探针：•切断的探针：检测不到报告荧光检测到报告荧光激发光激发光能量荧光共振能量转移，FRETLifeTechnologies™Proprietary
26、20变性(95ºC)LifeTechnologies™Proprietary
27、21退火(60ºC)LifeTechnologies™Proprietary
28、22LifeTechnologiesLifeTechnologies™
29、Proprietary
30、23LifeTechnologies™Proprietary
31、24LifeTechnologies™Proprietary
32、25LifeTechnologies™Proprietary
33、26LifeTechnologies™Proprietary
34、27?LifeTechnologies™Proprietary
35、28Taqisspecial...5′-3′外切酶活性水解探针，使报告基团和淬灭基团分离LifeTechnologies™Proprietary
36、29LifeTechnologies™Prop
37、rietary
38、30LifeTechnologies™Proprietary
39、31LifeTechnologies™Proprietary
40、32LifeTechnologies™Proprietary
41、33LifeTechnologies™Proprietary
42、34Life
