《荧光定量操作》word版

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1、样品取回后，冻于-70冰箱中。样品包括组织样和血清样品。检查目的基因的表达情况。需要作的工作如下：1、首先是组织总RNA的提取。提取步骤见TRNZOL试剂说明书。2、组织mRNA提取后进行反转录，得到cDNA样品。3、以CDNA样品为模板进行特定基因的扩增（可先用普通PCR验证/为了验证表达的差异，应采用定量PCR，并选用内参基因）注意：为了让提取的RNA质量可靠，每次研磨的组织样品不能过多，这就要求我们在取样是不能取太多的样品，而且所取样品必须准确、可靠。否则会导致后续试验都不准确。一．总RNA提取准备工作：、（一）基本器材和

2、试剂1．实验器具与材料（1）移液枪：1ml、200ul、10ul（2）枪头：1ml、200ul、20ul（3）枪头盒：1ml一个,200ul和20ul的枪头盒至少一个（4）EP管1.5ml、100ul（5）研钵:据一次提取RNA样品多少定.（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶：100ml（8）广口瓶几个（配75％乙醇，盛放氯仿，异丙醇等用）2．实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于0.1%DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜,然后送至高压锅灭菌(121-126℃

3、)至少30分钟，后在60-70℃烘烤箱中烘干，试验前将枪头放入枪盒。优级耗材可直接使用。（2）玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）先泡酸过夜，冲洗干净后，在0.1%DEPC水中泡8小时左右(过夜)，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤(100-200℃)3次。（3）金属制品：（镊子等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）3．试剂配制和准备（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。DEPC处理水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40u

4、lDEPC，37℃过夜，送至高压去除未反应的DEPC。（2）75％乙醇（最好在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3),然后放于-4℃预冷备用。（3）异丙醇：放入棕色瓶。（4）氯仿：放入棕色瓶。（5）Trizol：100ml/瓶存放于4℃。4.抽提RNA工作台面准备1.在仅用于RNA抽提的超净工作台抽提RNA2.工作台面用用RNAase失活剂处理。（二）总RNA提取步骤：1.采样样品采集需均一，迅速，组织样品避免血液污染，样品采集后迅速置于液氮或是-70℃.2.样品的研磨:先用少许液氮将研钵冷却,

5、然后取少许组织样放于盛有液氮的研钵内迅速研磨成细粉末，取约少100mg样品于预先加入1mlTrnzol的EP管中,用力颠倒混匀，室温静置5分钟,充分裂解细胞。3.加入氯仿向每管中加0.2ml氯仿。盖紧管盖，用漩涡振荡仪振荡15s（也可用手用力振荡1分钟左右），使其充分混匀，静置2-5min。4.离心分离4℃下12000g离心15分钟,样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μl）转移到新管中，注意不要吸取到蛋白层。5.转移上清将含有RNA的上层清液转移到新的1.5mlEP管中后（

6、约500ul),再加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀后静置10分钟6．RNA沉淀然后4℃12000g离心10分钟,弃上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成白色胶状沉淀。7.RNA洗涤加入1ml75%乙醇(4摄氏度预冷)，轻轻洗涤沉淀,4℃，7500g×5min，弃上清。注意在倒出液体时不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。此步可重复.8. 晾干室温放置晾干（不要晾的过干，RNA过分干燥后会很难溶解，大约晾干2－3分钟左右，见乳白色沉淀变成透明胶冻状即可）9.溶解根据实验需要及得

7、到RNA量的多少，加入30-100μl无RNase水，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。为了保证RNA的浓度在可用范围，可使用20-30μl水溶解。若浓度过大可再稀释。预防RNase污染，应注意以下几方面：1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。3．RNA在TRNzol试剂中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌

8、，即可去除RNase。4．配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌）。TRnzol法抽提总RNA流程图液氮研磨组织并取样约100mg,加入预先盛有1mlTRnzol的EP管中振荡混匀后