资源描述：
《重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、重组门冬酰胺酶Ⅱ的制备摘要：L-天冬酰胺酶具有显著的抗肿瘤作用，尤其是广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗。采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组L-门冬酰胺酶Ⅱ。关键字：L-门冬酰胺酶Ⅱ;制备；分离;纯化；稳定剂1.L-天冬酰胺酶治疗ALL的作用机制L-天冬酰胺酶(E.C，3.5.1.1)是酰胺基水解酶，是1个广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的酶类药物。L-天冬酰胺酶在机体内可催化天冬酰胺的水解，生成天冬氨酸和氨，在大量的ALL病人中，其肿瘤细胞依赖外源性的L-天冬酰胺才
2、能生存，而正常细胞自身能合成L-天冬酰胺。L-天冬酰胺酶抗白血病的作用机制是它能够快速消耗血循环中的L-天冬酰胺，从而消耗肿瘤细胞合成蛋白质所必需的底物，快速抑制蛋白质合成，而不影响正常细胞，此即L天冬酰胺酶的选择性细胞毒作用。[1]2.L-天冬酰胺酶的分离纯化工艺2.1酶的几种提取方法L-天冬酰胺酶最初是从豚鼠的血清中提取的，含量很低，后来开发发酵法生产，采用大肠杆菌;欧文菌以及粘质赛氏杆菌(serraliamarcescem)等产生菌制备。大肠杆菌产生的L-天冬酰胺酶包括天冬酰胺酶I和天冬酰胺酶Ⅱ，其中天冬酰胺酶I没有抗癌活性，存在于细胞质中，而
3、有抗癌活性的天冬酰胺酶Ⅱ则分泌到细胞周质中。大肠杆菌来源的天冬酰胺酶的提取方法常用有冷丙酮干燥破壁、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁法等.2.1.1蔗糖溶液提取法向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液(蔗糖40%，溶菌酶200mg/L，EoTA10mmol/L，pH7·5)，在30C振荡2小时，8000r/min离心30分钟，收集上清酶液。2.1.2冷丙酮干燥破壁法将菌体悬液倒入10倍量预先冷却的丙酮中，搅拌15分钟，5000r/min离心20分钟收集沉淀，于室温风干、研碎。向菌体干粉中加入10倍体积0.0lmol/L，pH8.0硼酸缓冲液.于室温
4、下搅拌30分钟，加入氯化锰溶液沉淀核酸，离心收集上清酶液。2.1.3反复冻融法将菌体在-30C和室温两种温度反复冻融9次，用30mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)浸提30分钟，8000r/min离心回收上清酶液。1.5.4超声破壁法l克湿菌体悬浮在40毫升10mmol/L、pH7.5磷酸缓冲液中，超声处理(输出300W，超声10秒，间隔30秒)20分钟。处理过程中用冰浴降温。用氯化锰沉淀核酸，400or/min离心20分钟回收上清酶液。由刘景晶等[2]实验验证蔗糖溶液提取法的提取收率最高。2.2酶的纯化为了保护酶的活性在固相分离沉淀时采用较为温和的
5、硫酸铵分级沉淀具体方法为用蔗糖溶液提取法获得的酶液，加入硫酸按至55%饱和度，调pH至7.0，室温搅拌1小时，离心除去沉淀。上清液中加入硫酸按到90%饱和度，离心收集沉淀。实验验证破壁液中酶浓度高于378IU/ml时,酶易与杂质-起沉淀,回收率下降,但过低时,虽然回收率增高,但杂质的去除率必定会下降,故应选择378IU/ml左右进行沉淀。在pH为4.9时,盐析的沉淀效果最好,回收率达89.1%。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用10mmof/L、pH7·6的磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素DE52层析柱(
6、r.0又30em)。用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为40ml/h。收集显示天门冬酰胺酶活性的组分。将洗脱液调pH4.8，通过预先用50mmol/L、pH4.9磷酸缓冲液平衡的cM-纤维素eM52层析柱(1.0X8.oem)，用50mmof/L、pH5.2磷酸缓冲液洗脱，收集显示天门冬酰胺酶活力的组分，冻干后得天门冬酰胺酶冻干粉。由蔡丽萍等[3]研究发现在DEAE-Sepharose层析柱纯化之后增加-个亲和层析。亲和层析柱对L-天门冬酰胺酶的专-吸附性大大提高了分离纯化的分辨率。2.3冻干状态下酶保护剂的选择王宏等[4]实验证明,在溶液状态下
7、酶与甘露醇之比为1∶2(W∶W)时,在冻干状态下酶与甘露醇之比为1∶1(W∶W)时,保护作用最佳。与无稳定剂酶组相比,溶液状态及冻干状态的t25℃0.9分别增加16.5倍和7倍..3蛋白质浓度测定按Lowy法用Folin酚试剂测定。4高效毛细管电泳WatersQuanta4000E石英毛细管,l=37.5cm。流动相80mmol/LPO3-4,pH7;电压12kV,电流68μA,进样方式及时间H/10s,检测波长214nm。参考文献[1]吴晓英，吴振强，林影，夏枫耿.L-天冬酞胺酶的研究进展[J]广东药学2003年第13卷第6期[2]刘景晶,金健勤,
8、戴海滨,吴梧桐.大肠杆菌L-天门冬酸胺酶的提取和纯化[J]药物生物技术1995，2(l)[3]蔡丽萍,杨冠东
