门冬酰胺酶的制备与分析.doc

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1、重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山1原理本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。本实验主要

2、进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。2实验材料实验仪器见表1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。表1.1实验仪器或装置仪器名称型号生产厂家超净工作台PCR扩增仪恒温培养箱超低温冰箱台式离心机恒温摇床涡轮振荡器高压灭菌锅蛋白电泳仪核酸电泳仪凝胶成像仪紫外分光光度计高效液相色谱仪扫描型紫外分光光度计制冰机超声清洗机　　实验试剂和材料见表1.2。材质或规格以及来源

3、根据实验需求以及实验室现有条件核定。表1.2试剂和材料试剂或材料材质或规格来源E.coli野生型菌株CPU21009实验室储存pMD18-T50ng/μl宝生物工程有限公司pET-22b50ng/μl宝生物工程有限公司NdeⅠ10U/μl宝生物工程有限公司XhoⅠ10U/μl宝生物工程有限公司T4DNALigase350U/μl宝生物工程有限公司DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司胶回收试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司CaCl260mmol/L实验室储

4、存PBS50x实验室储存NaCl分析纯Taq酶Mix分析纯(NH4)2S2O8分析纯C2H6OS分析纯CH4O分析纯冰乙酸分析纯C2H6O分析纯氨基丁三醇分析纯考马斯亮蓝分析纯SDS分析纯Nessler's试剂Reagent,ACS美国Spectrum公司酵母粉分析纯L-天冬酰胺分析纯英国OXOID公司蛋白胨分析纯甘氨酸分析纯琼脂糖分析纯葡萄糖食品级TEMED优级纯溴酚蓝分析纯IPTG优级纯丙三醇分析纯　3实验思路与步骤本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。后分别构建重组克隆载体和表达载体，将克隆载体导入

5、宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。后将构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养，利用IPTG诱导表达重组蛋白，对重组蛋白进行提取纯化。再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳测定分子量以及进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较。同时，实验过程中以纳氏试剂法监控L-天冬酰胺酶酶活力，并计算回收率。3.1大肠杆菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的获取3.1.1大肠杆菌ansB基因的选择与引物从NCBI中查找获取大肠杆菌ansB的基因序列，其GeneID为947454，基因长度为1047bp,序列如下：1atggagtttttcaaaaagacggcacttgccgcactgg

6、ttatgggttttagtggtgcagca61ttggcattacccaatatcaccattttagcaaccggcgggaccattgccggtggtggtgac121tccgcaaccaaatctaactacacagtgggtaaagttggcgtagaaaatctggttaatgcg181gtgccgcaactaaaagacattgcgaacgttaaaggcgagcaggtagtgaatatcggctcc241caggacatgaacgataatgtctggctgacactggcgaaaaaaattaacaccgactgcgat301aagaccgacggcttcgtcat

7、tacccacggtaccgacacgatggaagaaactgcttacttc361ctcgacctgacggtgaaatgcgacaaaccggtggtgatggtcggcgcaatgcgtccgtcc421acgtctatgagcgcagacggtccattcaacctgtataacgcggtagtgaccgcagctgat481aaagcctccgccaaccgtggcgtgctggtagtgatgaatgacaccgtgc