重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法.doc

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1、重组门冬酰胺酶Ⅱ的表达纯化与分析【引言】左旋门冬酰胺酶(Lasparaginase,LSP)是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。然而,LSP可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了LSP的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用LSP,就成为一个急需解决的问题。目前国内所有化学治疗中应用的ECII主要是依赖进口,完成表达ECII的基因工程菌株构建,并逐步进行ECII的工业化生产,对于国内ALL的临床化疗有积极意义。为此,我们克隆了ECII的基因,在大肠杆

2、菌中获得了高效表达,并探讨了其突变复性及后续纯化的简便方法。国内亦开展了类似的工作。【目的要求】1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。2．掌握以基因工程菌种E.coli/pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。【实验原理】L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，EC3.5.1.1)广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每

3、一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(AcuteLumphoblasticLeukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L

4、-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。国内目前用药全靠进口。1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌，重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138356Da，pI为4.85，紫外最大吸收值在278nm处。本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ，再用硫

5、酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ。并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析。rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订。取1ml0.04mol/LL-门冬酰胺，1ml0.1mol/LpH8.4硼酸-硼酸钠缓冲液，0.2ml细胞悬液或酶液于37℃保温15min，速加1ml50%三氯乙酸终止反应，4000r/min离心沉淀细胞。取上清液1ml，加奈氏试剂2ml和双蒸水7ml，放置15min后，于500nm波长比色。在上述规定条件下，将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μ

6、g分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位（OD500=0.07时为1U）。比活力测定方法为：精称纯化产物10mg，溶解于1mlH2O中，采用Lowry法测定蛋白质含量，并测定酶活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力。rL-ASPⅡ比活力=酶活力(U)/蛋白含量。【实验材料】1．器材（1)基因工程菌菌种：E.coli/pANS2为本实验室保存；（2)其他同前实验二十三器材。2．试剂重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备和酶活力测定：（1)培养基：种子培养基（LB液体培养基）；发酵培养基（玉米浆培养基）：玉米浆50g/L，牛肉浸膏35g/L，味精10g/L，pH7.0，高

7、压灭菌。接种前在无菌条件下加入抗生素氨苄青霉素。（2)氨苄青霉素(Amp)；（3)破壁液：45%蔗糖，10mmol/LEDTA，200mg/L溶菌酶，pH7.5；（4)奈氏试剂：称碘化钾5g加入5ml蒸馏水中，边搅拌边滴加25％氯化汞饱和液至稍有红色沉淀出现。再加40ml50％氢氧化钠溶液，最后用蒸馏水稀释至100ml，混匀入棕色试剂瓶中置暗处保存；（5)1mol/L氯化锰（MnCl2）；（6)5mol/L磷酸缓冲液(pH6.4)；（7)pH8.4硼酸缓冲液：0.858g硼砂(MW=381.37)，0.680g硼酸(MW=61.83)，用蒸馏水稀释至