l-门冬酰胺酶(asp)新纯化工艺项目总结

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1、L-门冬酰胺酶(Asp)新纯化工艺项目总结1项目背景L-门冬酰胺酶(L-asparaginase:Asp)是一种酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，它能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨，是一种重要的抗肿瘤药物，临床适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)的诱导缓解期疗效最好。目前生产门冬酰胺酶的工艺很多，纯化工艺更是千差万别。以往的研究一般仅局限于

2、实验室制备或小批量生产，经过复杂的纯化步骤获得纯度及活性符合要求的产品，但收率低，成本高，特别是操作成本占整个纯化成本的很大部分。如果不考虑产品成本，仅为获得符合要求的产品，上述数种工艺尚还可行，但是从获取生产利润的角度这些工艺就不可行，而且在所有这些工艺中，生产过程的复杂性成为规模化生产的制约因素，如何开发即简洁又具有实际操作性的新生产工艺，实现Asp生产的规模化，获得高纯度、高活性、高收率的目标产品成为我们所要研究的课题。公司自生产Asp以来，一直采用初期研发阶段的生产工艺，步骤复杂、操作成本高、生产能力

3、受限。基于此我们从探索方便、简洁、高效的生产工艺入手，主要在纯化过程及精制过程两方面对现有工艺L-门冬酰胺酶(Asp)新纯化工艺项目总结1项目背景L-门冬酰胺酶(L-asparaginase:Asp)是一种酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，它能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨，是一种重要的抗肿瘤药物，临床适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)的

4、诱导缓解期疗效最好。目前生产门冬酰胺酶的工艺很多，纯化工艺更是千差万别。以往的研究一般仅局限于实验室制备或小批量生产，经过复杂的纯化步骤获得纯度及活性符合要求的产品，但收率低，成本高，特别是操作成本占整个纯化成本的很大部分。如果不考虑产品成本，仅为获得符合要求的产品，上述数种工艺尚还可行，但是从获取生产利润的角度这些工艺就不可行，而且在所有这些工艺中，生产过程的复杂性成为规模化生产的制约因素，如何开发即简洁又具有实际操作性的新生产工艺，实现Asp生产的规模化，获得高纯度、高活性、高收率的目标产品成为我们所要研

5、究的课题。公司自生产Asp以来，一直采用初期研发阶段的生产工艺，步骤复杂、操作成本高、生产能力受限。基于此我们从探索方便、简洁、高效的生产工艺入手，主要在纯化过程及精制过程两方面对现有工艺进行改进。2新工艺介绍新工艺分以下几步:(1)丙酮粉制作：将丙酮、离心后的湿菌体按2:1(v/w)比例混合，搅拌20〜30min,离心，过筛，自然晾干得丙酮干粉(2)抽提：将丙酮干粉与抽提buffer按1:20(w/v)比例混合,37°C,搅拌1〜1.5hr，得抽提液(3)纯化：抽提液加适量1MMnCl2溶液(1.5ml/g

6、powder),沉淀菌体碎片及核酸，离心取上清；以1MTrisbuffer调上清pH值至8.0，沉淀析出，离心取上清；加入0.5倍体积的乙醇，搅匀静置过夜，沉淀杂蛋白，离心得上清；再加入0.5〜0.75倍体积的乙醇，静置沉淀6〜8hr,离心得沉淀。将沉淀溶于适当体积的原buffer中，既得纯度大于80%,比活140〜200IU/mg的粗提品(4)精制：将上述纯化液分别过DEAE-Sepharose及CM层析柱，除去部分核酸及内毒素，既得符合要求的Asp产品3新工艺特点新旧工艺除最终精制过程略有相同之外，其它过

7、程差异较大，新工艺基本采用生化方法对体系进行分离处理，与旧工艺相比新工艺从以下几点取得突破：(1)操作步骤简单新工艺采用生化方法处理，只需经过三步沉淀即可得到相对高收率及高纯度的产品，而旧工艺一般要经过一次DE、二次DE、脱盐、三次DE、二次脱盐等5步才能得到与上述生化方法处理级别相当的产品(2)精制过程效率更高旧工艺采用挂DE、盐洗、脱盐、过CM柱的精制过程，脱盐采用G-25柱，受电导率限制，往往要经过多倍率稀释，劳动强度大，操作复杂。通过精制工艺的改进与优化，整个过程只需一步DE即可获得高纯度的Asp产品

8、，再过CM柱除内毒素即可出原液(3)全程运行时间明显缩短生化处理方法固有的简单性决定了整个过程的处理时间大大缩短，新工艺步骤简单省时省力，全程仅需2〜3天时间，且大部分时间用于静置沉淀，而旧工艺因为存在反复DE处理及脱盐操作，耗时较长，每批大概需要3〜4天的时间，且工人劳动强度较大(4)新工艺试剂耗用量少，综合成本低，收率高新工艺体系小，前期纯化处理全部采用价廉易得的丙酮、乙醇试剂，试剂耗用量低且可