第十六章细胞因子和细胞粘附因子测定.ppt

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1、第十六章细胞因子与细胞粘附因子的测定第一节　生物学测定方法一、促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法二、细胞毒活性测定法三、抗病毒活性测定法四、趋化活性测定法五、生物学活性测定方法学评价第二节免疫测定方法一、ELISA方法二、流式细胞分析法三、酶联免疫斑点试验四、免疫学测定方法学评价第三节细胞因子与细胞粘附分子测定的临床应用一、临床应用原则二、特定疾病诊断的辅助指标三、评估机体的免疫状态、判断治疗效果及预后思考题小结是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。细胞因子细胞粘附因子是介导细胞间及细胞与细胞外基

2、质间粘附作用的分子，其化学本质为糖蛋白，可以细胞膜表面表达和可溶性两种形式存在。第一节生物学测定方法1.基于DNA检测的分子生物学测定法：DNA扩增法RNA印迹法原位杂交法核酸酶保护分析2.生物活性测定法生物学测定法分类根据细胞因子特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示生物活性测定法原理有助于细胞因子检测的活性作用包括有助于细胞因子检测的活性作用刺激细胞增殖或集落形成的活性维持细胞生长和存活的特性抑制细胞生长或破坏细胞的效应促进细胞趋化或抗病毒作用以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子

3、刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。一、促进细胞增殖和增殖抑制测定法直接计数法简便、直观,但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化细胞代谢活性测定方法3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法细胞代谢产物测定法代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法细胞增殖检测方法分类通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定优点

4、缺点方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染(1)放射性核素掺入法常见细胞因子3H-TdR掺入检测法所需细胞及参考试验条件细胞株所需浓度（细胞数/ml）3H-TdR前培养时间3H-TdR后培养时间检测细胞因子D10G4.12×1054818-20IL-1L9292×1055616IL-1CTLL-2105244-6IL-2FDC-P1,32DCL-275×104244-8IL-3CT.4S105244-6IL-4CH125×103486IL-5B135×1043612IL-5T88-M1×1052412IL-5BCL1105726IL-5Clone-K,I×N/2bx105244-6

5、IL-7TS13×104666IL-9T10105726IL-11UT-71.5×105726SCF（干细胞因子）CCL-64*5×108728TGF-βDA3.15,IF5×104244-8GM-CSFM14/NES60.45×104244-8M-CSF/G-CSF特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关测定步骤类似相同点不同点与同位素掺入法相比掺入物：MTT而非3H-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同(2)MTT比色法细胞株/原代细胞细胞终浓度（细胞数/ml）加入MTT前温育时间（h）检测细胞因子B9，MH60,BSF

6、2,TTD15×104/2×10596/48IL-6B9-115×10496IL-11B9-1-35×10496IL-13KYM-1D42×10372MV-3D95×103120TGF-βWEHI-164/clone132×10372TNF32D/Mp110S1×10344L9292×10556TNFCTLL-210522-24IL-2小鼠基质细胞,32DCL-271.5×10572IL-3细胞增殖或抑制活性检测的MTT比色法常用靶细胞对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断

7、指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。试验时，与细胞增殖或抑制方法一样，以已知活性的细胞因子标准品为对照。死、活细胞情况可用同位素51Cr释放法判断，或应用台盼兰染色死细胞后直接计数。也可通过结晶紫、萘酚蓝黑、MTT、NBB等着染活细胞，再用脱色液脱出染料后酶标仪比色测定吸光值。死细胞数、51Cr释放量越高或比色测定的吸光值越低，表明待测细胞因子的细胞毒活性则越高。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定