高速逆流色谱分离纯化抗生素ppt课件.ppt

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1、高速逆流色谱分离纯化抗生素郑卫（福建省微生物研究所福州350007）内容提要一高速逆流色谱技术简介二溶剂选择在逆流色谱中的重要性三高速逆流色谱技术分离纯化抗生素实例一高速逆流色谱技术简介高速逆流色谱(HighSpeedCounterCurrentChromatography,HSCCC)a多层盘绕管；b平衡物优缺点（与HPLC等液-固色谱技术比较)优点分离原理不同：互补性强无需固体作固定相：不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗（HPLC的1/10以下），运行使用的后续投入较低溶剂极性可调：无需更换不同极性的色谱柱

2、即可实现流动相从弱极性到强极性或相反的转化色谱柱无填料，柱内空间全部是有效空间，容积大：样品负载能力强，制备量大，重现性好盘管总体积100mL，一次分离量：0.5-2克盘管总体积3000mL，一次分离量：15-60克缺点分离效率（理论塔板数）还不高（<1000)N=5.54(tR/W1/2)2一次分离所需时间还较长（以小时计）基本原理以及溶剂系统选择等还不完善相应的配套检测器还不够完善（溶剂干扰）分离后样品的纯度还需HPLC等方法测定混合溶剂的回收二溶剂选择在高速逆流色谱中的重要性分离度Rs:2(tR2-tR1)/W1+W2提高分离度的方法CCC&CPC:(tR2-tR1),HP

3、LC:W1+W2样品：极性、溶解度、纯度（预处理）溶剂：两相溶剂的体积应尽量相同，挥发性较强样品+溶剂：沉降时间（<30秒)，以得到满意的固定相保留率分配系数(K):上相中样品浓度/下相中样品浓度0.2～2,1最佳样品各组分间的分离因子(,各组分的K值之比)>1.5溶剂系统：固定相保留率：>75%表1最佳溶剂体系选择表极性较弱溶剂最佳溶剂极性较强溶剂heptane,CHCl3THFH2Oheptane,toluene,MiBK,CHCl3,EtOAcACOH2OheptanemethylethylketoneH2OTHFDMSOH2Otoluene,MtBE,MiBK,EtOA

4、cMeCNH2Oheptane,toluene,CHCl3,EtOAcBuOHH2Oheptane,toluene,CHCl3,EtOAcPrOHH2Oheptane,CHCl3,EtOAcEtOHH2Oheptane,toluene,CHCl3,EtOAc,BuOHMeOHH2Oheptane,toluene,CHCl3,MiBK,EtOAc,BuOHHOAcH2OCHCl3HCOOHH2O非水体系HeptaneTHF,DMF,EtOAc,PrOH,EtOHMeOH,MeCN逆流色谱中常用的几个三元溶剂体系相图Type1:Chloroform/Methanol/Water应用：杆

5、菌肽，Niphimycin，克念菌素，HerbicidinsA,B等Type2.Ethylacetate/butanol/Water应用：WAP-8294A，弱极性样品Type0:Water/Dimethylsulfoxide/Tetrahydrofuran应用：极性强的难溶性样品如两性霉素BCPCseparationofAmphotericinB(peak7)Water-DMSO-THF(24.6:16.2:59.2,V/V/V)溶剂系统的选择与优化步骤1:采用简单的梯度洗脱系统如水-乙腈（100:00:100）用HPLC对样品进行极性扫描分析，得到样品的极性范围步骤2:溶剂系

6、统的优化区域化合物极性溶剂系统A强极性正己烷/正丁醇/甲醇/水B中极性正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水C非极性正己烷/乙腈步骤3:溶剂比例的优化一次只改变一种溶剂的量取少量样品在试管中进行分配系数实验TLC或HPLC测定实验结果实例：孢绿菌素(Sporaviridins)的分离SporaviridinsA1A2B1B2C1C2R1HHHHOHOHR2OHOHNH2NH2OHOHR3C2H5CH3C2H5CH3C2H5CH3孢绿菌素：碱性，水溶性，抗G+菌和毛癣菌等。化学结构：含七个糖元的34元大环内酯化合物，主要有6个组分，由于结构非常相似，用HPLC等方法难以分离。溶解性：只溶于极性溶

7、剂如水、甲醇和正丁醇等。HSCCC方法：溶剂系统选择：正丁醇/水：主要分布在上相（正丁醇），因此，必须降低孢绿菌素在上相中的溶解度。方法：加入非极性溶剂如正己烷和乙醚。正丁醇/乙醚/水：先固定正丁醇和水的体积（各10mL)，加入不同体积的乙醚，发现10：4：10（V/V/V)效果较好。再固定正丁醇/乙醚10：4，调整水的体积，确定正丁醇：乙醚：水为10：4：12。HSCCC：固定相保留率：75%，分离时间：3.5h，洗脱体积：500mL分离前粗品15mg，分离后分别得