实验五、PCR扩增和琼脂糖电泳检测.doc

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1、实验五、PCR扩增和琼脂糖电泳检测一、实验目的学习和掌握PCR扩增及琼脂糖电泳的基本原理和方法。二、实验原理多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互

2、补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。因此，首先在待扩增的DNA片段两侧设计寡核苷酸引物，经变性（94℃）、退火（45~68℃）和延伸（72℃）若干个循环后，DNA扩增2n倍。所使用的酶为耐热的DNA聚合酶（Taq酶）。琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行

3、电泳的技术。主要用于生物大分子的分离、纯化与鉴定。DNA分子在高于其等电点的PH值溶液中带负电荷，在电场中向正(阳)极移动。其迁移速度与其分子量大小成反比。电泳后，不同大小的DNA片段呈现迁移位置的差异，把已知分子量的标准DNA即Marker，与待测DNA同时电泳，比较两者在琼脂糖凝胶板上的区带位置，即电泳图谱，就可以鉴定出待测DNA的大小及浓度。荧光染料EB（溴化乙锭）能嵌入DNA分子碱基对中，在紫外光下发荧光，据此可测知DNA片段所在的位置。将DNA加到凝胶的负极，在电场的作用下，将不同大小的片段分开。三、仪器、材料与试剂（一）仪器：

4、微量移液器，PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统及紫外检测系统（二）材料与试剂：基因组DNA，dNTPs（2.5mmol/L），上下游引物（浓度10μmol/L），rTaq酶（5U/μL），DL2000DNAMarker，10×PCR缓冲液，MgCl2（25mM）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖（注意：溴化乙锭，EB，致癌），电泳缓冲液(0.5%TBE，含Tris碱、硼酸和EDTA，PH8.0)，.二甲苯菁和溴酚蓝）。四、实验步骤1、PCR扩增反应体积（20μl），在0.2mlEppendorf中依次加样：10×PCRbuffer2.0μlMg

5、Cl21.6μldNTPs1.6μl上游引物0.5μl（10μmol/L）下游引物0.5μl（10μmol/L）DNA1.0μlddH2O12.6μlrTaq0.2μl反应条件：94℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃30s（循环28次），72℃5min在PCR扩增仪上进行扩增。2、琼脂糖凝胶电泳检测配置1.5%琼脂糖凝胶，取5μlPCR扩增产物+1μl上样缓冲液电泳。DNA带负电荷，电泳时DNA从负极向正极泳动（即点样孔在电泳槽的负极，注意不要将胶方向放反）。待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。五、

6、作业写出实验的过程并描述你所观察到的结果，绘制电泳凝胶图。琼脂糖凝胶电泳时有哪些注意事项？影响DNA分子在琼脂糖凝胶中电泳速度的因素有哪些？GTAACAAAGGAAAAGTTGCTGCATTTACATGAGCTAGTTTGAGAACAGCTAGCTGCTGGTCACATAGTGCCTACTACCAGCCCTTGGAATACTCCAGTCTTTGTTATCCTCAAGAAGAGTGGAAAATGGAGGCTTTTACAGGACCTGCACACTGCCAATGCAGCAATTGAGCCCATGGGGGCATTGCAGCCTGATCTTCCTT

7、CGCCTTCAATGTTACCTGTGAATTGGTACGCAGTC上游引物5′-AGTTGCTGCATTTACATGAG-3′下游引物CAGGTAACATTGAAGGCGAA