pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳讲义(工艺实验)

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1、t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义一、实验目的1、掌握PCR反应的原理和方法；2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。二、实验原理PCR原理：首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火。使引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。每经过一次变性，退火，延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过约30次后，所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍，由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这周而复始的过程中每完

2、成一个循环，就基本上使目的DNA物增加一倍。变性（denaturation）：双链DNA在92－96℃变性成单链DNA。退火（annealing）：引物在45-72℃与模板的互补区域相结合。延伸（extension）：在72℃条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端，DNA链的延伸方向为5’-3’。DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷，外加电场用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射

3、下，DNA呈现橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5-0.1μg，溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10mg或更少的DNA即可检出。三、实验仪器超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70℃）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。四、实验药品蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB、臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、Na

4、OH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH2O、EB、EDTA、SDS、引物。五、实验内容本实验为综合性实验，主要从以下几方面开展。1、设计PCR反应系统根据PCR反应系统的组成和要求，设计20μL或50μL的反应体系，可以下表1提供的50μL的PCR反应体系为参考。表1PCR反应体系组分原液浓度加量（μL）终浓度Buffer10×51×dNTP10mmol/L10.2mmol/L引物15μmol/L10.1μmol/L引物25μmol/L10.1μmol/LTaq酶5U/μL0.20.2U/μL模板DNA0.218mg/μL14.36μg/μLMgC

5、l27DdH2O33.8总体积502、进行PCR反应PCR反应过程学生自行设计，可参考下列提供的PCR反应条件：94℃，5min（热启动）；94℃，1min（变性）；52℃，1min（退火）72℃1.5min（延伸）；循环30次；72℃，10min；保温湿度；4℃。3、对PCR反应产物进行水平板琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定将PCR反应产物通过水平板球脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定，琼脂级凝胶电泳的具体方法如下：1）根据所需浓度称取一定量的琼脂糖。加入一定量的1×TAE或其它缓冲液，加热使琼脂糖溶解。2）溶液冷至60℃时，若需要，则加入溴乙锭至终浓度为0.5μ

6、g/mL（也可以在电泳之后再进行染色。）。3）琼脂糖倒入制胶模具，凝胶厚度一般为0.3-0.5cm。迅速在模具一端插上梳子，检查有无气泡。4）室温下放置30-45min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子将凝胶放置于电泳槽中。5）加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面1mm，凝胶两端的电压与外加电压相等。6）在DNA样品中加入1／6的上样缓冲液，混匀后，离心聚集液体，使溶液全部汇集于管底部，用移液枪将加样混和液加入样品孔中。7）接通电泳槽与电泳仪的电源，电压降选择l～5V／cm。8）根据指示剂迁移的位置来断定是否终止电泳，切断电源后再取出凝胶，未加

7、EB的凝胶需要在含有EB的缓冲液中浸泡约20～25min。9）取凝胶在凝胶成像系统中检测电泳结果。t-PA是组织型纤溶酶原激活剂，由527个氨基酸组成。t-PAcDNA大小约1．6kb。六、实验结果的讨论1、PCR反应的原理是什么？影响PCR反应的主要因素是什么？2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么？如何选择琼脂糖凝胶的浓度？EB的作用是什么？