【实验】DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

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1、第3节聚合酶链式反应技术犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。多聚酶链式反应(PCR技术)是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程美国科学家　穆里斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术19

2、93年诺贝尔奖温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？脱氧核糖含氮碱基磷酸AGCT1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸12345O5OHATGCATGC脱氧核苷酸链的形成2、DNA分子的平面结构识别：-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。5'端含磷酸基团3'端（含羟基）3'端5'端DNA分子的复制过程是怎样的？DNA分子的复制需要哪些条件？温故知新2解旋酶催化（氢键断裂）解旋：模板（在DNA聚合酶的催化下，利用游离的脱氧核苷酸进行）以母链

3、为模板进行碱基配对母链（旧链）子链（新链）形成两个子代DNA:同时进行(边解旋边复制）组成DNA复制过程DNA复制的基本条件：模板:原料:酶:能量:DNA的两条链四种脱氧核苷酸ATP解旋酶、DNA聚合酶小资料：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—G引物ⅡDNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要

4、引物。DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：细胞内DNA复制的基本条件打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸解旋酶（打开DNA双链）DNA母链（模板）4种脱氧核苷酸（合成子链原料）DNA聚合酶（催化子链合成）引物（RNA）（使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸）自主阅读P77-79，并思考：体外扩增DNA，需要怎样环境？变性

5、（80-100℃）Taq聚合酶（耐高温）20—30个核苷酸构成DNADNA母链4种脱氧核苷酸缓冲溶液，控制温度体内复制DNA体外扩增DNADNA双链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）DNA单链变性的目的：解开双链复性的目的：有利于引物与两条单链的结合DNA分子的热变性原理PCR扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。DNA模板温度设备:PCR仪自动调控四种脱氧核苷酸引物耐热的DNA聚合酶一定的缓冲溶液一、

6、PCR反应的条件PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸二、PCR反应的过程1．变性双链模板DNA解离为单链结构。（90～95℃）DNA双链DNA单链变性2．复性（退火）两种引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。（40～60℃）引物3．延伸在Taq聚合酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃延伸变性第二次循环复性第二次循环延伸第二次循环①②③④25次经25次循环（复制）后，DNA的含量理论上可以扩大到倍。225每次循环分为：PCR的反应过程总结变性——复性——延

7、伸②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸PCR的反应结果PCR产物鉴定：琼脂糖凝胶电泳技术电泳仪电泳槽琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物现场嫌1嫌2嫌3嫌4嫌5三、PCR的应用研究-基因克隆、测序、分析突变诊断-细菌、病毒、寄生虫检测、诊断人类基因组工程-遗传图谱的构建、测序、表达图谱法医-犯罪现场标本分析肿瘤检测其他……课堂小结多聚酶

8、链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增练习巩固1、下列关于PCR技术的叙述不正确是（　　）A、PCR全称是多聚酶链式反应B、PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的技术C、PCR的原理是DNA双链复制D、PCR反应需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶D2、实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（