小室迁移实验.doc

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1、小室迁移实验[精华提要]小室迁移实验已被广泛用于研究不同类型包括转移性肿瘤细胞的细胞活力。该实验对检验趋化因子或细胞趋化抑制剂的化合物是有用的。检测依赖于透水层的支持，通常这是组织培养处理的微孔滤膜，它位于两个小室之间，模仿两个不同的微环境对细胞生存/生长。细胞在膜的一侧，从小室的另一侧感应的趋化因子，可以通过微孔膜迁移。被移植的细胞可以用简单的固定/染色的计数方法量化。人类乳腺上皮腺癌MD-231细胞生长比较快，是转移性的。以下就以MB-231细胞细胞株为例描述细胞迁移实验的基本程序。材料，试剂和

2、设备1.人类的MDA-MB-231细胞（ATCC＃HTB-26）2.Dulbecco的改良Eagle培养基，DMEM（Invitrogen公司＃10313-021）3.胎牛血清（ATCC＃30-2020）4.胰蛋白酶/EDTA（Invitrogen公司＃25200-056）5.胰蛋白酶抑制剂，大豆（Invitrogen公司＃17075-029）6.PBS（Invitrogen公司＃14190-144）7.I型胶原（Sigma-Aldrich公司＃C7661）或纤维连接蛋白（BD公司＃）8.Corni

3、ng?Transwell?聚碳酸酯膜嵌入物（Sigma-Aldrich公司＃CLS3421），或Millicell小细胞培养嵌入物（Millipore公司＃PI8P01250）9.戊二醛（Sigma-Aldrich公司＃G6257）10.乙醇（Sigma-Aldrich公司＃）11.结晶紫（Sigma-Aldrich公司C3886）12.棉签13.细胞培养孵化器：37°C和5％CO2。TCC制定Leibovitz的L-15中型，ATCC＃30-2008程序1.MB-231细胞装入含10％胎牛血清的D

4、MEM（如果需要的话使用L–15介质）。2.洗两次，用1xPBS和胰酶消化细胞。3.将0.5mg/ml的胰蛋白酶抑制剂的PBS加入到等量的灭活胰蛋白酶。吸细胞轻轻吹打向上和向下，重要的是尽可能分解成单个细胞。4.轻轻吹打掉细胞。用含0.5％FBS的DMEM洗涤细胞2次，以去除微量胰蛋白酶和抑制剂。重悬于0.5％FBS的DMEM并计数的细胞。5.要准备的Transwell小室，24孔的格式，8微米的插入孔径：1)在下格添加0.5％FBS的DMEM2.6毫升（含有40微克/毫升胶原蛋白I）2)装入Tra

5、nswell聚碳酸酯膜嵌入物。6.注意：确保无气泡在膜和介质之间。7.从第4步开始，在上层室，轻轻地添加1×105细胞。8.在Transwell小板中以37°C，5％，CO22.5小时孵育的细胞。这使得细胞通过过滤膜迁移到过滤器的底部。9.2.5小时后，轻轻地去除嵌入膜，没有迁移的细胞因此留在滤膜上侧，并小心用棉签去除。尽可能完全的净化过滤器。10.过滤器的下侧细胞迅速由5％戊二醛固定10分钟11.过滤器的下侧的细胞用含有1％结晶紫的2％的乙醇染色20分钟。12.快速在ddH2O洗去多余的结晶紫。用

6、棉签插入两侧排出多余的水分。干燥插入膜。13.统计显微镜观察到的过滤器的下侧细胞数量。随机选择不同的视野，并计算平均数。14.应进行相同的实验程序，对照组无趋化因子。每个迁移条件应做重复测试。