体内药物分析方法的建立和验证.ppt

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1、第四章体内药物分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据一.待测药物的理化性质及体内存在状况1.待测药物的理化性质1）待测药物的pKa值及其亲脂性、水和有机溶的分配系数等决定萃取方法2）药物挥发性判定是否GC检测3）药物的紫外、荧光、电化学特性决定检测方法4）药物酸碱、光、热的稳定性2.待测药物的体内状况1）蛋白结合强时，不宜用溶剂萃取2）原形药物与代谢物共存时，分离度是否良好3）药物浓度过低采用高灵敏度方法2.分析测定的目的与要求1）药代动力学研究A:测定血中的药物和代谢物B:要求较宽的线性范围（Cmax/Cmin1/10-1/20）C:较高的

2、灵敏度（10-9g/ml）、准确度D:分离度大于1.5E:常用的仪器HPLC、GC、LC-MS2）血药浓度监测A:要求线性在有效浓度范围内B:分析方简便、易行、适用于长期和批量样品测定C:常用的仪器TDX3.生物样品的类型与样品制备方法A:生物样品的类型与样品制备与分析方法与有密切关系B:血浆血清，用蛋白沉淀-溶剂萃取技术，HPLC测定C:用RIA时样品的预处理可粗放4.试验室条件A:试验室设备B:试验人员C:验室SOPD:分析软件第二节分析方法建立的步骤一.分析方法的选择A:样品中的药物浓度是分析方法的首要因素B:样品中的药物浓度10-6-10-

3、9g/mlC:HPLC法检测限：紫外（UV）1ng；荧光0.1ng；电化学（EDD）0.01ng二.分析方法的建立1.检测条件的筛选A:取标准物质待测物质；内标物质B:根据已知的分析方法进行测定C:根据测定结果确定最佳条件：溶液pH值；温度及时间；试剂用量；色谱条件2.分析条件的选择1）空白溶剂试验A:取待测药物非生物基质溶液，按拟定的方法预处理，分析方法的特异性B:空白响应值应尽可能小或可忽略2）空白生物基质试验A:取空白生物基质（血、组织匀浆），照空白溶剂试验下操作B:考察杂质对测定的影响C:杂质不干扰测定3）模拟生物样品试验A:取空白生物基质

4、加入待测物制成模拟生物样品B:照空白生物基质试验下操作C:考察方法的专一性；线性范围；最小检测限；精密度；灵敏度；萃取回收率4）实际生物样品测定A:预试确定实际生物样品与模拟生物样品一致性B:正式试验按所建立的分析方法分析C:比较实际生物样品与模拟生物样品相应特点D:计算体内药物浓度第三节分析方法的验证内容和要求一.分析方法的选择A:用于实际样品分析之前，对所建立的方法的可靠性、可行性，应使用若干技术指标验证B:验证步骤分析方法验证；实际生物样品中药物测定一）特异性：又称专属性、专一性，与选择性互用A:是指当有杂质存在时，方法准确测定待测物的能力。

5、通常表示所检测的信号应属于待测物所特有B:用来验证该方法所测定的物质是目标物质，且不受非目标物质的干扰1.内源性物质的干扰A:比较待测物的对照品、空白生物基质、模拟生物样品的检测信号，确证内源性物质对分析物有无干扰B:比较的内容Tr；n；T；R2.代谢产物干扰比较模拟生物样品和实际生物样品的检测信号（Tr；n；T；R），确证代谢产物对分析物有无干扰3.配伍用药的干扰A:比较待测药物、同时服用的药物、空白生物样本、待测药物模拟生物样品、待测药物+同时服用的药物模拟生物样品的检测信号B:比较的内容Tr；n；T；R4.与参比方法的相关性A:参比方法选择（

6、HPLC、GC）B:同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品C:参比方法测得值为横坐标（x），拟定的方法测得值为纵座标（y），求回归方程y=a+bx，r为一致成度；a为拟定方法受恒定干扰程度；b为拟定方法受比例干扰程度。D:r=1a=0b=1两种方法一致二）标准曲线与线性范围A:又称校正曲线、工作曲线。是指生物样品中药物浓度与所测定的该药物的检测信号的相关性，通常用回归方程评价。B:大多数方法的标准曲线为线性模式。回归方法为最小二乘法和加权最小二乘法C:生物样品中药物浓度为自变量（x），检测信号为因变量（y），回归方程为y=a+bx，r为相关系

7、数D:线性范围，浓度不能外推E:标准曲线模拟生物样品的生物基质应使用与待测的实际生物样品的生物基质相同1.标准曲线系列溶液的配制1）精称标准药物适量，配贮备液2）精量配贮备液适量，配制系列标准溶液3）系列标准溶液浓度为模拟生物样品浓度的50倍4）加量为生物样本体积的2%5）难溶药物，适当降低系列标准溶液浓度，蒸干6）线性模拟的标准曲线5-8点；线性模拟的标准曲线增加7）标准曲线系列浓度为等梯度，公比为22.内标物溶液的配制1）精称内标物适量，配内标物贮备液2）精量配贮备液适量，配制内标物标准溶液3）内标物标准溶液浓度为“标准曲线系列浓度”的中间浓度

8、3.标准系列模拟生物样品的配制1）取空白血数份，加入“标准曲线系列浓度”适量（在加入内标液适量），混匀2）标准系列模拟生物