大规模蛋白表达.docx

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1、大规模蛋白表达（）简介（）蛋白质是行使生物学功能的最重要的一类分子。利用包括生物化学和生物物理学，特别是结构生物学等手段对蛋白质的研究，需要大量的高纯度的蛋白。利用异源表达宿主来表达重组蛋白是目前最常用的一种方式。蛋白表达系统有很多种，比较常用的有原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆虫细胞或者哺乳动物细胞）。不同的表达系统各有优缺点，而不同的蛋白对表达系统的要求也不同。这里仅介绍大肠杆菌表达系统。常用的大肠杆菌表达系统大多采用,它可以结合和的原件，对其控制的基因表达做调控。通常，目的蛋白的表达可以用过添加（比如）来实现。更多关系表达

2、载体的信息，请参见载体部分。材料（）o试剂（）ü培养基ü抗生素（根据载体抗性而定）ü（细菌用，其他用。如果发现不够用时这样配：称至无菌玻璃瓶，加入无菌水，摇至完全溶解即可。极易溶于水。一般一部分分装到管，剩余倒在离心管保存在℃即可。注：由于冰的密度为，而水的密度是，所有需要冻在冰箱里的一切溶液都不要装满，否则会炸裂。）短期大规模使用情况下，可以不用分装，保存在℃冰箱便于使用。ü：,,,ü:,,,ü:,,o实验前准备（）ü确保以上试剂够用ü大量干净的短玻璃管，实现用蒸馏水冲一遍并烘干ü高压灭菌的玻璃量筒（细菌时用）ü浓缩管（）在威红姐座位上面的柜子

3、里。注意不一样的（常用，，，），选择小于蛋白一半的。比如的蛋白，用不大于的浓缩管。o器械（）离心机（使用前预冷至℃），金属煮样器，真空泵，上样泵，纯化仪实验步骤（）摇菌►1.先挑一点甘油冻存保种细菌至含有抗生素的培养基中，培养大半天。（5/5小时内一定要变浑，否则之后即使变浑浊也可能不是你要的细菌。做甘油冻存的时候细菌状态要好，浓度要高。加入甘油以后要混匀。注意尽量避免反复冻融甘油冻存菌。）1.将菌液转移至或者中，℃培养过夜。▲关键步骤：如果表达量很高的蛋白一般足矣，因此转至中；而表达量较低的蛋白需要，因此转至中。大规模培养►1.向培养基中加入抗

4、生素（稀释至），以及（每升中加）和葡萄糖（每升中加－）。添加是为了提高细菌的生长速度和状态，而添加葡萄糖是为了抑制泄露表达，因为它是通过降低宿主细菌内的（激活因子，增加的表达）的水平来实现的。2.用无菌的玻璃量筒将过夜培养的菌液平分至升中。3.搬到℃摇床中摇，摇至值为（需要约小时）。▲关键步骤：一般把手放在锥形瓶下方，如果你透过菌液看不到自己手时可以去测了。4.由于实验室大摇床降温速度较慢，提前开始降温至℃。冷却半小时后加入。▲关键步骤：如果是()需要的，其他菌种的即可。诱导时间一般小时足矣，其他特殊蛋白需要过夜诱导，根据情况而定。5.提前预冷离

5、心机。把菌液倒入离心机配套的塑料筒中，一共有个筒，如果只要种蛋白就不用写蛋白的名称，但是如果摇好几种蛋白时一定要贴上标签（不要直接用比写在上面，如果擦不干净日积月累上面就会满满的字，不仅看着丑，而且再往上写你自己也不知道到底哪个是你的字）。根据液面配平，×离心。▲关键步骤：如果两种蛋白时，三个筒放一种蛋白，三个筒放另一个蛋白，这样虽然一次离不完，但也不用中间再洗这些筒。吸菌液做样品，纯化之前先确保蛋白表达与否。6.准备干净的大勺和小药匙，每升产生细菌比较正常。金属烧杯提前称好，贴上标签纸写明目的蛋白以及烧杯的重量。测湿重可以知道是否有融菌等异常。

6、7.离心之后将上清直接倒干净，用勺把细菌从上面抠下来，再用药匙把细菌从大勺转移到金属烧杯中。先放在冰上。▲关键步骤：两种蛋白时一定要看好蛋白名称，千万不要弄混。8.同样的方法，将剩余的菌液全部离心，最后称金属烧杯和细菌的总重量，减量法计算湿重。9.离心筒和勺上会残留一些细菌，用将剩余的细菌冲下来倒入烧杯中，用铝箔纸封口，暂时放在℃／℃冰箱。▲关键步骤：一般几级别的蛋白足矣，能用搞定的蛋白不需要。纯化蛋白超声►1.先把金属烧杯从冰箱拿出来，放在温水中解冻。根据细菌湿重加入，，用小药匙搅拌均匀。可以用磁力搅拌子转一会。解冻可以加快。尽量保持细菌在低温

7、，不要在温水中放太长时间，防止蛋白质的降解。如果观察到蛋白有部分降解现象，要从裂解液开始的所有里加()。2.将烧杯至于冰中进行超声破碎。参数：，，破碎，停止，约分钟左右。超声仪探头放在液面下－处，离底不能太近。如果放在太靠上会产生很多气泡。超声至菌液稀如水，没有丝毫粘稠物。▲关键步骤：超声仪参数按个人习惯可以调，但不要超声太久，菌会焦掉，等离心的时候沉淀中有黑色的东西就说明超声太久了。5/5纯化蛋白离心、过滤►1.提前换的转子，换成装离心管的小转子，预冷离心机至℃。以后我们把小转子倒置放在度冰箱预冷。2.将菌液倒入离心管，配平，×离心。上清倒入小

8、烧杯中。3.将过滤用的滤器组装好，注意不要漏了，接上真空泵，把收集瓶放在冰上预冷。将滤膜贴在细孔上，用尽量少的润湿，并把旋盖拧紧。打开泵