哺乳细胞蛋白表达案例

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1、哺乳细胞蛋白表达案例1.实验目的以客户提供的目的蛋白基因构建表达载体，通过哺乳表达体系获得目的蛋白X。2.实验设计（1）分析客户提供的目的蛋白序列，设计蛋白表达方案；（2）选择钟鼎特色载体pAZ-V5，构建表达质粒pAZ-V5-X；（3）转染293F细胞进行蛋白表达，通过WesternBlot检测蛋白X是否表达；（4）通过Ni柱纯化获得目的蛋白X，SDS-PAGE检测纯化蛋白纯度，BSA方法测定蛋白浓度。3.蛋白分析（1）经EditSeq翻译目的蛋白X序列：m.w.=39.27kd，pI=8.52（2）经UniProt匹配，蛋白X物种

2、来源：草鱼（3）目的基因稀有密码子分析及蛋白结构分析目的基因稀有密码子分析蛋白亲疏水分析蛋白跨膜结构域分析蛋白信号肽预测分析结果：①目的基因不含哺乳表达体系稀有密码子。②目的蛋白整体呈亲水性、无跨膜结构域、无信号肽序列。结论：将目的基因构建在钟鼎特色载体pAZ-V5上，利用载体自带信号肽分泌表达，并在目的蛋白C端添加His标签便于纯化。1.表达载体构建1.1pAZ-V5-X质粒酶切验证：钟鼎特色载体pAZ-V5酶切鉴定Marker:250,500,750,1000,1500,2000,2500,3000,4000,5000,6000,

3、8000,12000Line1:酶切前质粒Line2:酶切后质粒基因名称：X（OD260/OD280:1.82）酶切位点：EcoRI/BamHI4.2pAZ-V5-X质粒测序验证：部分序列比对结果图1.蛋白表达及纯化纯化蛋白WesternBlot鉴定分析M:蛋白质分子质量标准1:纯化蛋白蛋白表达WesternBlot鉴定分析M:蛋白质分子质量标准1:细胞裂解上清2:细胞上清3:细胞裂解上清（阴性）4:细胞上清（阴性）纯化蛋白XSDS-PAGE胶灰度值分析纯化蛋白XSDS-PAGE(reduced)分析M:蛋白质分子质量标准1:纯化蛋白

4、2.蛋白内毒素检测凝胶半定量试验：平行管供试品稀释倍数阴性对照阳性对照反应终点稀释倍数Log10平均值Log10-11:21:41:81:161:321:641+------+1:2（0.5）-0.301-0.3010.5（1：2）2+------+1:2（0.5）-0.301纯化蛋白内毒素浓度=鲎试剂灵敏度λ×反应终点稀释倍数的几何平均值=0.03EU/ml×2=0.06EU/ml1.实验结论目的蛋白X在293F细胞中得到表达，并且经过Ni柱纯化蛋白纯度（SDS-PAGE胶灰度值）到达99%，纯化蛋白内毒素含量为0.06EU/ml。