研究蛋白表达系统

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1、研究融合蛋白表达系统1研究人员在分离到某一基因后，会呈现出对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是蛋白表达。有目的性地合成外源基因产物。从而在重组DNA技术的发展早期，硏究人员认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。蛋白表达随后,认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密

2、码子的简并性改变末端编码序列往往有助于解决问题。通常,两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中,目的基因被引入某个表达蛋白序列(fusiontag)的末端，比如大肠杆菌的一段序列,或者任何可在大肠杆菌中高度表达的基因,它提供良好表达所必需的信号”而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusiontag编码的片段。fusiontag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6xHisTag.[3■半乳糖苗酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S■转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋白CTrx)融合蛋白等。伯乐生命(bio-ra

3、d.com)由于利用tag的特性通常可以对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，更多情况下选择融合表达是为了简化重组蛋白的纯化。因此出现两种融合表达类型：一是fusiontag位于目的蛋白的N端，这时tag可以提供良好表达所必需的信号,蛋白表达帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白z原因是在翻译过程中意外中断的少量(C端)不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusiontag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusiontag位于C端可能减少对其功能的影响，

4、反之亦然。进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，蛋白表达它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusiontag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。裂解融合蛋白以除去fusiontag为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusiontag部分。早期已建立了数种对融合蛋白逬行位点特异性裂解的方法。化学裂解如漠化m（Metl）xBNPS-3-?基II引味（Trpl）.轻胺（AsnlGly）等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性

5、低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和”更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中有用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。蛋白表达所有这些酶都具有较长的底物识别序列（如在凝乳酶中为7个氨基酸）”从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。而酶解法存在成本高（这些蛋白酶价格一般都相当昂贵）”反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。IMPACT系统的推出是融合表达系统的一个重大突破。该系统最大的优点是

6、表达的融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusiontag的精确切割。IMPACT（InteinMediatedPur币cationwithanAffinityChitin-bindingTag）系统利用一个来源于枯草杆菌的5kDa大小的几丁质结合域（chitinbindingdomain,用于亲和纯化）和一个来源于酵母intein蛋白质组成一个双效的fusiontag,再与克隆到多克隆位点的目的基因融合表达。Intein是一个蛋白质剪接元件，类似于基因组中的内含子intron在RNA的剪接中所起的重要作用,intein在较低的温度

7、和还原条件下发生自身介导的N端裂解,可以释放出与之相连的目的蛋白。也就是说融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4度）条件下用含DTT,或者疏基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱，而将fusiontag留在纯化柱上。而还原剂的小分子可以非常简单的去除。蛋白表达该系统的出现是融合表达系统的重大突破”完全避免了蛋白酶的使用”不但可以有效降低成本”提高效率，也避免了蛋白酶与目的蛋白的分离纯化的麻烦。伯乐生命（bio-rad.com）随后推出的IMPACT-CN系统提供了两种选择，即fusiontag可以选择在目的蛋白的C端或

8、者N端，使克隆或表达都能满足不同需要。但是这一系统仍然有一个缺陷，那就是含有较多二硫键的蛋白不适用这一系统，因为还原剂的存在会破坏/影响蛋白的二级结构。IMPACTTWIN的推出为我们带来了更