大规模蛋白表达Largescaleproteinexpression.doc

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1、大规模蛋白表达（Large-scaleproteinexpression）简介（INTRODUCTION）蛋白质是行使生物学功能的最重要的一类分子。利用包括生物化学和生物物理学，特别是结构生物学等手段对蛋白质的研究，需要大量的高纯度的蛋白。利用异源表达宿主来表达重组蛋白是目前最常用的一种方式。蛋白表达系统有很多种，比较常用的有原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆虫细胞或者哺乳动物细胞）。不同的表达系统各有优缺点，而不同的蛋白对表达系统的要求也不同。这里仅介绍大肠杆菌表达系统。常用的大肠杆菌表达系统大多采用T7promo

2、ter,它可以结合Lacoperon和Araoperon的原件，对其控制的基因表达做调控。通常，目的蛋白的表达可以用过添加inducer（比如IPTG）来实现。更多关系表达载体的信息，请参见载体部分。材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）LB培养基抗生素（根据载体抗性而定）1MIPTG（plys细菌用0.7mM/L，其他BL21用0.2mM/L。如果发现不够用时这样配：称11.9gIPTG至无菌100ml玻璃瓶，加入50ml无菌水，摇至完全溶解即可。IPTG极易溶于水。一般一部分分装到1.5mlEp管，剩余倒在50ml离

3、心管保存在-20℃即可。注：由于冰的密度为0.9，而水的密度是1，所有需要冻在冰箱里的一切溶液都不要装满，否则会炸裂。）短期大规模使用情况下，可以不用分装，保存在4℃冰箱便于使用。Ni-bindingbuffer：0.5MNaCl,16mMImidazol,10mMTris-HCl,pH8.0Elutionbuffer:0.5MNaCl,400mMImidazol,10mMTris-HCl,pH8.0Gelfiltrationbuffer:0.25MNaCl,10mMTris-HCl,pH8.020%EtOHLDS4Xloading

4、buffer实验前准备（SETUP）确保以上试剂够用大量干净的短玻璃管，实现用蒸馏水冲一遍并烘干高压灭菌的100ml玻璃量筒（dilute细菌时用）浓缩管（Millipore）在威红姐座位上面的柜子里。注意cutoff不一样的（常用3kDa，10kDa，30kDa，50kDa），选择小于蛋白一半的cutoff。比如20kDa的蛋白，用不大于10kDacutoff的浓缩管。器械（EQUIPMENT）Thermo离心机（使用前预冷至4℃），金属煮样器，真空泵，上样泵，AKTAFPLC纯化仪实验步骤（PROCEDURE）摇菌?Day11.

5、先挑一点甘油冻存保种细菌至5ml含有抗生素的LB培养基中，培养大半天。（5小时内一定要变浑，否则之后即使变浑浊也可能不是你要的细菌。做甘油冻存的时候细菌状态要好，浓度要高。加入甘油以后要混匀。注意尽量避免反复冻融甘油冻存菌。）2.将5ml菌液转移至250ml或者1LLB中，37℃培养过夜。▲关键步骤：如果表达量很高的蛋白一般3L足矣，因此转至250mlLB中；而表达量较低的蛋白需要12L，因此转至1LLB中。大规模培养?Day21.向LB培养基中加入抗生素（稀释至50-100ug/LKan/Amp），以及2MMgSO4（每升LB中加

6、1ml）和50%葡萄糖（每升LB中加5－20ml）。添加Mg2+是为了提高细菌的生长速度和状态，而添加葡萄糖是为了抑制泄露表达，因为它是通过降低宿主细菌内的cAMP（激活因子，增加T7polymerase的表达）的水平来实现的。2.用无菌的100ml玻璃量筒将过夜培养的菌液平分至N升LB中。3.搬到37℃摇床中摇，摇至OD值为1.2（需要约3-4小时）。▲关键步骤：一般把手放在锥形瓶下方，如果你透过菌液看不到自己手时可以去测OD了。4.由于实验室大摇床降温速度较慢，提前开始降温至18℃。冷却半小时后加入IPTG。▲关键步骤：如果是B

7、L21(pLys)需要0.7mM/L的IPTG，其他菌种0.2mM/L的IPTG即可。诱导时间一般4小时足矣，其他特殊蛋白需要过夜诱导，根据情况而定。5.提前预冷Thermo离心机。把菌液倒入离心机配套的塑料筒中，一共有6个筒，如果只要1种蛋白就不用写蛋白的名称，但是如果摇好几种蛋白时一定要贴上标签（不要直接用marker比写在上面，如果擦不干净日积月累上面就会满满的字，不仅看着丑，而且再往上写你自己也不知道到底哪个是你的字）。根据液面配平，4700rpm×20min离心。▲关键步骤：如果两种蛋白时，三个筒放一种蛋白，三个筒放另一个

8、蛋白，这样虽然一次离不完，但也不用中间再洗这些筒。吸60ul菌液做SDS-PAGE样品，纯化之前先确保蛋白表达与否。6.准备干净的大勺和小药匙，每升产生3-5g细菌比较正常。金属烧杯提前称好，贴上标签纸写明目的蛋白以及烧杯的重量。测湿