微生物培养技术的形成.doc

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1、摘要：遍布于地球上各种生境屮的微生物具有丰富的物种多样性。迄今为止，能够在实验室条件下培养的微生物仅仅是其中的一小部分，微生物物种的绝大多数还都难以在现有培养技术和条件下进行繁殖和生长。人们把那些尚未在实验室获得培养生长的微生物称之为未培养微生物(Unculturedmicroorganisms)。对未培养的微生物的研究方兴未艾，主要是讨论有关环境微生物的遗传多样性分析等。木文概述了一些制约微生物培养生长的影响因索，重点介绍了近年来出现的一些新颖独特的环境微生物培养技术和方法,包括稀释培养法、高通量培养技术、模拟白然环境的扩散盒技术等。这些新颖培养技术和培养方法的出现，显著提高了微

2、生物的可培养性，发现和鉴定了许多新的微生物物种，极大地丰富了可培养微生物的多样性和微生物资源，并为深入研究和开发微生物奠定了良好的资源研究基础。关键词：环境微生物，未培养微生物，新培养技术微生物培养技术的形成，萸定了微生物分类、生理、遗传等当代微生物学各个领域发展的基础。研究和分析表明，

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4、然界屮绝大多数微生物在现有条件下尚不能被传统的微生物技术培养出来，依照现有的培养技术和方法，不同生境微生物可培养率的检测结果是：海水中约为0.001%-0.1%,淡水中约为0.25%,土壤中约为0.3%,活性污泥中约为1%—15%。人们把那些在现有培养技术条件下尚未茯得培养生长的微生物泛称为未

5、培养微生物(Unculturedmicroorganisms)0研究表明，自然界中微生物的多样性远远超过了以前人们的想彖。现在人们一般认为，环境微生物中99%以上是诡未能被培养的。在原核生物的40个分类门屮，有一半还没有纯培养出代表种。尽管人们还无法分离培养大部分的微生物,但是可以绕过培养障碍，通过运用分子生物学的手段来鉴定某些未知的微生物，这在探究原因不明的传染病时特别有用。环境中绝大部分的微生物还不被人类所认识，这暗示其屮蕴含着大量未知的遗传信息。从未培养的微生物中克隆新的基因，已逐渐成为近年一大研究热点领域，也获得了相当的成果，得到了许多功能更强、结构更新的基因及基因家族。概

6、括起来主要有两种方法。第1种是鸟枪法。第2种方法是PCR扩增法。两种方法各有优缺点：用鸟枪法得到新的基因(特别是新的基因家族)的可能性较大，但是需要构建较大的基因文库，筛选的工作量大,且容易漏筛活性较弱的克隆菌以及表达载体不适合的基因；PCR扩增法比较简单，工作量较小，但需要用已知基因的保守序列作为引物，因而发现新的基因家族的可能性也校小。为了克服两种方法的不足，有的学者把两者结合起来。他们对PCR法进行改良，采用的引物不是某一个特定基因的序列，而是一些伴随基因的可移动元件的保守序列，如质粒、转座了、柴合了等。这种方法结合了传统鸟枪法和PCR法的优点，既减少了筛选的工作量，又能得到

7、较多的新基因及新基因家族。但是，由于没有明确的功能基因指向，利用这种方法得到的多半是些功能未知的基因。研究者开发出一系列不依赖微生物培养技术的研究方法，例如变性梯度胶凝胶电泳(DGGE)、荧光标记细菌寡核廿酸探针细胞原位杂交(FISH)、DNA芯片•、宋基因组测序分析等。不过，该类方法也同时带来木身固有的弊端。例如，对微生物从细胞水平上呈现出的形态特征、生理特性、代谢功能、环境胁迫效应的生物丿应答等，难以进行实验研究,致使无法准确了解微生物细胞的生命活动；难以对微生物群落屮不同种群间的相互作用、相互协调的动态过程和变化规律进行科学描述和验证，进而无法对环境微生物工艺过稈进行准确设计

8、、精细调控和高效利用。因此，在利用分子生物学技术研究微生物多样性、开发环境微生物基因资源的同时，需要不断研发新的微生物培养技术，使以往被认为是不可培养的微生物源源不断地融入到可培养的行列之屮，才能真正深入和有效地研究和发现微生物生理遗传等生命规律，实现微生物资源的开发和利用。1制约微生物培养生长的因素地球上微生物生存的环境类型多种多样，除了普通的白然环境外，还存在着各种极端环境，海洋热液喷口(Deep-seahydrothermalvent)就是典型的极端生境Z—。由于这种极端环境条件下的众多复杂因素，特别是深海高压的限制，人工条件下还无法完全模拟自然环境，因此，许多微生物仍然是不

9、可培养的，对其物种多样性和系统发冇树的研究主要依赖于分了生物学的方法。为了实现既定的研究目的，人们通常将微生物限定在营养基质简单、通气、温度、pH等参数恒定的条件下培养，许多微生物就此丧失了1=1由生长的必要条件，从而表现为不可培养。在环境屮，共代谢对于建立两个种群间的偏利共生关系起着很重要的作用，尤其在农药、人工合成染料、石汕泾类等有机污染环境屮，通常作为生物降解的重要途径。当微生物从白然环境转移到营养丰富的人工培养基屮时，一些摄取营养能力强的微生物会应运而生，而寡