微生物的形态观察与培养技术.doc

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1、微生物的形态观察与培养技术-产淀粉酶细菌的分离培养和观察实验一选择性培养基的制备和灭菌一、目的要求1.明确培养基的配制原理；2.通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤；3.了解高压蒸汽灭菌的基本原理以及应用范围；4.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二、基本原理牛肉膏蛋白腺培养基的一种应用最广泛和最普通的细菌基本培养基，有吋又称普通培养基，基础培养基含有牛肉膏，蛋白腺和NaCl,其屮牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白腺主要提供氮源和维生素，rfnNaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，多用于培养基细菌，因此要用稀酸和稀碱将其p

2、H调至屮性微碱性，以利于细菌的生长繁殖。在培养基中添加淀粉作碳源，可筛选岀产淀粉酶的菌株。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密封的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧的将冷空气从排气屮驱除尽，然后关闭排气，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从血使沸点增高，得到高于100。C的温度，导致菌体蛋白凝固变性而达到灭菌的H的。三、器材1•实验样品：地农5cm以卜土壤样品，而粉样品，小米样品2•试剂:牛肉膏，蛋白腺,淀粉,NaCl,琼脂，lmol/LNaOH,lmol/LHClo3•仪器：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙

3、，pH试纸，麻绳，，培养皿，酒精灯，手提式高压蒸汽灭菌锅，空气灭菌干燥箱等。四、操作步骤1.无菌器材准备：每组准备12套培养皿，6支lml移液管，2个刮刀，用报纸包扎，150~170°C条件下干热灭菌2h。另准备三角瓶1个，加入99ml无菌水和玻璃珠若干包扎，取试管7支，每支加入4.5ml水，与后述培养基一同进行湿热灭菌。2•培养基的配制与灭菌1~4组配制试管斜面培养基，准备试管50支，共配制500ml培养基分装。5〜8组配置平板固体培养基，准备三角瓶8个,瓶内加入琼脂（按200ml培养基计算）,共配制1600ml培养基进行分装。1.1称量按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏，蛋

4、白月东，NaCl放入烧杯屮，牛肉膏用玻棒挑取，放在小烧杯或表而皿称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放称量纸上，称量后直接放入水屮，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。2.2溶化在上述烧杯屮先加入少于所需要的水量，用玻璃摇匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌溶解。将药品完成溶解后，补充水到所需总体积。2.3调节pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培养基中滴加入lmol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。反之，用lmol/LHC1进行调节。3.4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管

5、内或者三角烧瓶内。3.5加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。3.6包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌吋冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制FI期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用容易解开,同样用记号笔注明培养基名称，组别，配制H期。3.7灭菌将将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水而与三角搁架相平为宜,放回内层锅，并装入培养基，加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，0」03MPa,121°

6、C并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关闭排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加血逐渐丄升；当锅内压力升到所需压力时，维持压力至所需时间。20min后，切断电源或者关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，开盖取出物品。3.9倒平板、搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50°C左右，将试管口端搁置在玻棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜而长度以不超过试管总长的2/3为宜。每组倒固体平板12个。4.样品稀释分离与接种4」编号取无菌平皿6套，分别用记号笔表明1010仝IO'6(稀释度)各2套。另取4只盛有4.5ml无菌水的试管，编

7、号依次是10=1010104.2稀释用1ml无菌吸管吸取1ml己充分混匀的样品悬液，精确地放0.5ml至10’的试管屮，此即为1()倍稀释。将多余的菌液放回原菌液屮。将KT?试管置试管震荡器上震荡，使菌液充分混匀。另取一只1ml吸管插入10“试管屮來回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。用此吸管吸取0.5ml至10一4试管中，其余以此类推稀释至10'。4.3取样接种用三支1ml无菌吸管分别吸取10IO-'和10'的稀释菌悬液各0.2ml,对号放入编号好的无菌平皿屮，用无菌刮刀均匀