基于高通量测序的红豆杉EST—SSRs标记研究-论文.pdf

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1、第37卷第24期VoL37．Issue24巾国中药杂志2012年12月ChinaJournalofChineseMateriaMedlcaDeeember，2012基于高通量测序的红豆杉EST—SSRs标记研究吴琼，段小群，陈旭，肖培根(1．桂林医学院药学院，广西桂林541004；2．中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京100193)[摘要]目的：利用高通量测序，对红豆杉Taxuscuapidata转录组进行EST—SSRs发掘和研究。方法：提取红豆杉叶片cDNA，应用454GSFLXTitanium测序，采用NewblerAssemblerSoftware软件对序列(

2、high—qualitysequences)进行从头拼接，获得一致件序列(uniquesequences)。用SimpleSequenceRepeatIdentificationTool(PerlScript)对一致性序列进行分析，检索SSRs模体；采PRIMER3设计扩增引物。结果：高通量测序获得红豆杉81148条ESTs，经拼接得到20557条uniquese—quenees，从中发现了753个EST—SSRs。依据其邻近序列设计引物，共有519条EST—SSRs获得了扩增引物。存红豆杉EST—SSRs中随机挑选序列构建小样本，克隆测序结果表明87．5％的序列与Sanger测序

3、结果一致。结论：首次获得了红豆杉属EST—SSRs，为红豆杉的种质资源培育、功能基因及基因组差异研究奠定了基础。[关键词]东北红豆杉；EST—SSRs标记；高通量测序；表达序列标签东北红豆杉Taxuscuspidata要分布于中国吉Ts)建立的分子标记，代表了基因组编码区域，直接林、辽宁、黑龙江三省，1993年被列为国家一级保护反映决定其重要表型的基因信息。由于它的高度多植物，也是国际公约保护濒危物种1-2J。1971年，态性，以及在单个位点上可作共显性等位基因分析，Wani等从红豆杉中分离出具有抗癌活性的化合物近年来作为比较理想的分子标记在经济作物如水紫杉醇J。1992年底，美国

4、FDA正式批准紫杉醇稻、大麦、葡萄、苜蓿等中进行了鉴定和研究¨。作为治疗晚期卵巢癌新药。在全球热销抗癌药物在药用植物中，遗传标记的研究尚较少，限制了中，紫杉醇位居前列。通过红豆杉属不同种研究发分子标记的开发和应用。本研究率先对红豆杉转录现，东北红豆杉枝叶中所含的紫杉醇含量最高J。组进行高通量测序，发掘基因表达谱多态性标记然而东北红豆杉资源天然更新能力弱，种子萌发率(EST．SSRs)。研究结果将对红豆杉优良品种选育、和成活率很低，一般需要10～15年才能成熟。在树种质资源保护、功能基因鉴定和遗传图谱构建奠定皮中所含紫杉醇含量仅为万分之一，难以满足临床基础。需要。目前，关于红豆杉生长

5、发育，地理分布，1材料生态学，组织培养】，遗传多样性l9J，内生真十五年生东北红豆杉cuspidata采自中国医菌]，化学成分⋯】，生物合成途径等方面研究学科学院药用植物研究所栽培基地。用纯净水洗净较多，对于其遗传标记研究相对缺乏。表面并用滤纸吸干水分，立即用液氮速冻，带回实验微卫星标记是最常用的遗传标记之一，它是分室保存在一80。c冰箱中备用。布在真核生物基因组上的一些短的、串联重复序列2方法simplesequencerepeats，简称SSRs)。它的组成基元2．1RNA提取和cDNA合成采用RNeasyPlant是2～6个核苷酸，通过串联重复序列的数目变化而Kit(BioT

6、eke，Beijing，China)提取RNA，Oligotex@呈现高度的多态性¨。传统SSRs开发需要获得基mRNAKit(Qiagen，Hilden，Germany)分离纯化L大]组序列数据，开发成本高且步骤繁多。EST—SSRsmRNA。以2gmRNA为模板，SMARTPCR是基于表达序列标签(expressedsequencetags，ES-cDNASynthesiskit(C

7、ontech，MountainView，CA，USA)反转录合成cDNA。采用PCRAdvantageIIPolymerase(C

8、ontech)对cDNA进行扩增，扩增条件[稿件编号]20120

9、424002为95qC，1min；94(℃，15S；65oC，30S；68oC，6[通信作者]吴琼，博士，副教授，硕士生导师，从事药用植物分子生物学研究，E-mail：qwu9516@gmail．cornrain，13个循环。采用PureLinkPCRPurification·3728·第37卷第24期Vo1．37，Issue24巾陶中药杂志2012年12月ChinaJournalofCIl}neseMateriaMedicaDecember，2012Kit(Invi