5l发酵罐发酵l-乳酸（综合性试验）

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1、5L发酵罐发酵L-乳酸（综合性试验）实验指导书5L发酵罐发酵L-乳酸实验涉及微生物学，生物工程原理，有机酸工艺学，发酵工厂设备，工业发酵分析等多门课程内容。希望同学们复习这些相关知识，了解从生产菌种到发酵法制备大宗化工原料的全过程。一、实验目的1、学习掌握利用发酵法生产L-乳酸的原理和工艺操作。2、熟练掌握5L发酵罐的结构和使用方法。3、掌握L-乳酸、残糖和菌体浓度的测定方法。二、实验原理乳酸分子式为：CH3CH2OCOOH，分子量90.08，因为乳酸分子内含有一个不对称的C原子，从而具有D-型和L-型两种构型。L

2、-乳酸为右旋，D-乳酸是左旋的，当L(+)-乳酸和D（-）-乳酸等比例混合时，即成为消旋的DL-乳酸。乳酸生产有三种方法：化学合成法，酶法和微生物发酵法。发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖、等糖类或牛乳为原料，接种微生物经发酵而生成乳酸。乳酸发酵机理主要有:Ⅰ.同型乳酸发酵，Ⅱ.异型乳酸发酵，Ⅲ.双歧杆菌发酵。本实验用菌为嗜热乳酸杆菌(T-1)，发酵方式为同型乳酸发酵。发酵机理如下：葡萄糖经EMP途径降解为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。发酵方式如下：经过这种途径，1mol葡萄糖可以生成2mol乳酸，理论

3、转化率为100％。但由于发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能达到100％。一般认为转化率在80％以上者，即认为是同型乳酸发酵。工业上较好的转化率可达96％。三、实验用品1、实验器材全自动式5L发酵罐上海理工大学高机实业总公司）手提式压力蒸汽灭菌锅北京市将台医疗设备厂镇海联营厂752紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司MY－879型生化培养箱天津轻工业学院DGG型电热鼓风干燥机天津天宇机电有限公司YP1200型电子天平上海精密科学仪器有限公司GH801型超净工作台天津净化仪器厂TGL－16G台式

4、高速离心机上海医用分析仪器厂SBA－40C型生物分析传感器山东省科学院生物研究所HZQ－Q恒温振荡器东联电子技术开发有限公司蒸汽发生器DZF-3上海航星机械有限公司其他：量桶、烧杯、离心管、移液管、酒精等、接种环、PH试纸玻璃棒等2、试剂（1）种子培养基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）30、酵母膏5、蛋白胨5、CaCO310（2）发酵培养基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）100，酵母膏5、蛋白胨5、豆浓3（3）8mol/lNaOH溶液（4）消泡剂四、实验程序（1）分析方法1．葡萄糖和L-乳酸的测定发酵液中葡萄糖和乳

5、酸的测定采用SBA-40C型生物传感分析仪测定。方法：首先将发酵液离心，吸取上清液，稀释250倍，进样测定。2．菌体浓度的测定发酵液经高速离心后，用0.1moL/L盐酸溶液洗涤沉淀除去残余CaCO3，离心两次后，弃上清液，将菌体悬浮于10mL蒸馏水中，用分光光度计测定A580值。（2）操作方法1．玉米糖化液的制备把500g玉米粉加入到2000ml水中，每100g玉米加入1mlα-淀粉酶，先加入75%，搅拌均匀，在85～90℃保温1小时，加热煮沸，待温度再降至90℃时，加入另外的25%的α-淀粉酶，降温到50～60℃

6、，加5ml糖化酶保温6～8小时，得到玉米粉水解糖液。2．种子培养取新鲜斜面菌种一环，接入种子培养基中，于转速150r/min摇床中，50℃培养16-18h。3．5L发酵罐发酵①空消：空罐灭菌。②实消：将发酵培养基2.7L从进样口倒入5L发酵罐中，盖上盖子。检查发酵罐安装完好后，盖上灭菌罩，105℃灭菌15分钟。③校正：校正pH电极、溶氧电极（校正方法参考5L罐使用说明书）④接种与发酵：在接种圈的火焰保护下，将种子培养液300mL倒入发酵罐中，控制发酵温度50℃，pH为6.0,溶氧:0～20h通风60L/h，发酵罐搅

7、拌100r/min，20～72h停止通风和搅拌。以NaOH为中和剂。⑤测量：每隔4h取样，测菌体浓度、葡萄糖和L-乳酸浓度。(3)注意事项：①使用SBA～40C生物传感分析仪要严格按照使用说明进行，进样针使用完毕后要用蒸馏水清洗，以防进样针堵塞。②使用蒸汽发生器灭菌时注意蒸汽发生器压力不要太高，以免发生危险。五、实验数据处理发酵培养时，按照一定的时间间隔取样测定并记录，结果如下表。时刻时间／h葡萄糖浓度/(g/L)菌体浓度A600L-乳酸浓度/(g/L)签名12：00016：00420：00824：00124：00

8、168：002012：002416：002820：003224：00364：00408：004412：004816：005220：005624：00604：00648：006812：0072六、结果与讨论(1)　按照上表给出的相应数据，以时间为横坐标，表中数据为纵坐标绘图，分析各量的变化规律。(2)　糖酸转化率(%)：生成L-乳酸的克数与消耗葡萄糖克数之比的