大豆GmCAT4基因在毕氏酵母中的表达和功能鉴定-论文.pdf

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1、第33卷第3期大豆科学V0lJ33No．32014定6月S0YBEANSCIENCEJun．2014大豆GmCAT4基因在毕氏酵母中的表达和功能鉴定陈金峰，韩艳霞，焦婵(开封大学化学工程学院，河南开封475004)摘要：利用生物信息学分析了大豆GmCAT4蛋白的结构，其目的蛋白编码492个氨基酸，分子量为56．7kD，等电点约为6．80，同时预测了蛋白质的二级和高级结构。利用双酶切的方法从克隆载体pMD19一T—GmCAT4上双酶切下目的基因的cDNA，然后将其和表达载体pPIC9K进行连接，构建重组载体pPIC9K—GmCAT4，经电击转化入毕氏酵母，

2、PCR证实了GmCAT4基因已整合进酵母基因组。目的蛋白经甲醇诱导后，在上清和细胞内均有表达，发酵液上清粗酶活性为124．3kU·L～，诱导后的酵母对NaC1和H2O表现出一定的抗性。关键词：大豆；过氧化氢酶基因；毕氏酵母；表达中图分类号：$565．1文献标识码：ADOI：10．11861／j．issn．1000-9841．2014．03．0315ExpressioninPichiapastorisandFunctionalIdentificationofSoybeanGmC『AT4GeneCHENJin—feng．HANYan．xia，JIAOChan

3、(ChemicalEngineeringCollegeofKaifengUniversity，Kaifeng475004，China)Abstract：BioinformaticsanalysiswereconductedonthestructureofsoybcanGmCAT4protein，whichencoded492aminoacids．Themolecularweightoftheenzymewas56．7kD，andthep1was6．80，thesecondaryandtertiarystructuresofthepro—teinwerep

4、redicted．AfterdigestedbybothenzymesfrompMD19一T—GmCAT4，thetargetgenewasinsertedintoexpressionvec—torpPIC9K，andtheyeasestrainPichiapastoriswastransformedbyelectrophorationwithpPIC9K—GmCAT4．ItwasconfirmedthatsoybeanGmCAT4genewasintegratedintotheyeastgenomebyPCR．After96hinductionbyme

5、thanol，theproteinsinSU—pernatantandcelllysatesweremeasuredbySDS．PAGE，andtheactivityofthecrudeliquidenzymefromthesuperuatantreached124．3kU·L～．Thetransgeneyeaststrengtheneditsabilityofsaltandhydrogenperoxidetolerance．Keywords：Soybean；Catalasegene；Pichiapastoris；Expression过氧化氢酶(cata

6、lase，CAT)是需氧生物体内的清楚。酵母既具有原核生物易于培养、容易操作等保护酶，和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxi—特点，又具有真核生物的蛋白翻译后加工折叠等作dase，GPX)一起能够清除过氧化氢(HO)。大部用，而且其信号传导途径和转录应答模式与植物类分过氧化氢酶结构中都存在着铁卟啉辅基，辅基中似，所以利用酵母细胞研究植物基因的方法可为揭铁原子氧化还原态之间的可逆变化能够催化电子示植物基因功能提供借鉴。本试验对大豆的Gm—发生转移，使H：O分解为水和氧气，防止细胞遭受cA编码区进行克隆并完成其在酵母中的表达和氧化损伤。同时

7、过氧化氢酶作为信号分子HO的功能鉴定，旨在为进一步研究大豆过氧化氢酶的功关键控制酶，使H：O：处于动态平衡中，影响植物的能奠定基础。生理功能和生长发育¨j。与动物，特别是哺乳动物1材料与方法单个过氧化氢酶不同，植物过氧化氢酶一般有多个，例如拟南芥CAT1—3、玉米Cat1．3、烟草Catl一3、1．1材料南瓜car1．3、水稻CatA．C都属于过氧化氢酶，但他1．1．1质粒和菌种DH5ot大肠杆菌菌株、毕氏酵们表达的情况不尽相同，一类过氧化氢酶在光合组母GS115菌株及pPIC9K质粒由本试验室保存。织中表达强烈，二类过氧化氢酶在维管组织中表1．1．2主

8、要试剂限制性内切酶、T4DNA连接达，三类过氧化氢酶在叶子中表达微弱，但在种子酶