大豆过氧化物酶在毕赤酵母中功能表达-论文.pdf

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1、微生物学通报Sep．20，2014，41(9)：1850—1855MicrobiologyChina◎2014byInstituteofMicrobiology，CAStongbao@im．ac．cnDOI：10．13344~．microbio1．china．140232大豆过氧化物酶在毕赤酵母中功能表达黄建忠林剑辉石艺平胡美荣陶勇f1．福建师范大学生命科学院福建福州350108)(2．中国科学院微生物研究所北京100101)摘要：【目的】大豆过氧化物酶(SBP)作用底物广泛、比活高、热稳定性好，使其在免疫检测、工业污染废水

2、处理领域有着广泛的应用潜力。现有的生产方法主要是从大豆壳中提取，这种方法产量低，成本高，远不能满足于工业应用要求，本研究希望实现在毕赤酵母中高效表达有功能活性的大豆过氧化物酶。【方法】将大豆过氧化物酶基因以及C末端截短20个氨基酸的基因克隆pPIC．9K载体中，并在毕赤酵母x一33中诱导表达。同时还将糖基化位点的天冬酰胺突变成为谷氨酰胺，研究糖基化位点对表达的影响。【结果】全长SBP在毕赤酵母中表达是无活性的，只有截短的SBP△20在试管发酵的表达活力达23．5U／mL，经过糖基化位点的突变表明130、144、185、197

3、对酶活非常重要，不能突变；2ll和2l6位点去糖基化突变对酶活有所提高。【结论】经过发酵条件的优化，在5L的发酵罐中发酵液上清最高酶活力达510U／mL，是目前报道的最高水平。关键词：大豆过氧化物酶，毕赤酵母，去糖基化1E一x0ressi●onoi一soylbeanperoxi●alasel^romsoylbeanl●n1●C，■霉t‘apas』，．z●HUANGJian—ZhongLINJian—HuiSHIYi—PingHUMei．RongTAOYong(1．CollegeofLifeSciences，FujianNor

4、malUniversity，Fuzhou，Fujian350108，China)(2．InstituteofMicrobiology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China)Abstract：『Objective1Soybeanperoxidase(SBP)willbewidelyusedinimmunoassay,andwastewatertreatmentandSOon．duetoitswidesubstrates．highspecificactivity,andgood

5、thermalstabilitv．Nowadays。itwasobtainedmainlybyextractedfromsoybeanhul1．However,itcannotmeettherequirementsofindustria1applicationsforitslowyield．highcost．Inthisstudy,SBPwillbeexpressedinPichiapastoris．『Methods1Boththegenes0fSBPandtruncatedC—terminal20aminoacidSBPw

6、ereclonedintopPIC一9K．TheseconstructedexpressionvectorsweretransformedintoPichiapastorisX一33．andthenbeusedtoexpressSBPFurthermore．theeffectsofasparagineglycosylationonSBPexpressionwerealsoinvestigatedbymutatingasparagineintoglutamine．fResults1FulllengthofSBPisinacti

7、veinPichiapastoris．ButthetruncatedC—terminal20aminoacidSBPshowed23．5U／mL．Ourresultsindicatedthatglycosylationsiteof144．185．197haveagreateffectontheenzymeactivity．Thesemutantswerealmostinactive；Whereas2l1and216基金项目：福建省产业化关键技术项目(No．闽财指[20101358号)通讯作者：Tel：86—591—22868

8、212；函：hjz@gnu．edu．cn收稿日期：2014—03—20；接受日期：2014-04—15；优先数字出版日期(www．cnki．net)：2014．04．18黄建忠等：大豆过氧化物酶在毕赤酵母中功能表达185ldeglycosylationsiteshadlittleeffec