凝血因子ⅷ在毕赤酵母中表达

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1、摘要人凝血因子VⅢ(humancoagulationfactorW，hFW)在人凝血机制内部途径的级联反应中起着必不可少的作用，该因子的先天性缺陷会导致甲型血友病。目前，临床上治疗这种疾病多采用蛋白替代疗法，即输入含hFⅧ的制剂。世界上血友病患者众多，发病率在1／10000．3／10000。如此大的需求量单靠从血浆中提取无法满足市场的需求。因此，利用基因工程方法生产1lFⅧ无疑具有巨大的商业价值。鉴于毕赤酵母自身强力的表达系统，本文利用毕赤酵母GSll5为受体菌，筛选出能分泌重组人凝血因子Vi(recombinanthumancoagulationfactorⅧ，rhF

2、V$)的基因工程菌株，并对该蛋白的发酵条件进行初步研究。本文在构建rhFl／$基因工程菌时采用了适合该菌株的分泌型表达载体pPIC9，成功构建了重组表达质粒pPIC9．FVi。该质粒经SalI线性化，电转化整合入毕赤酵母GSll5的染色体中。经基因组PCR筛选出阳性克隆，MM和MD平板筛选出His+Mut+表型，BMGY／BMMY培养基摇瓶振荡培养，SDS．PAGE鉴定培养物上清等步骤，最终得到能表达rhFVliI的阳性菌株。对其表达模式的研究法发现，随着诱导时间的延长，该蛋白的表达量增加，并在144h达到高峰。本论文通过BMGY／BMMY培养基摇瓶振荡培养对发酵条件进

3、行了摸索。结果显示，在28℃，250rpm，每24h添加1％甲醇的诱导条件下rhFV$有微弱表达。以上结果表明，本研究利用毕赤酵母成功表达了llFⅧ蛋白，虽然表达量极低，但这为进一步研究11FⅧ在毕赤酵母中的高效表达打下了基础。关键词：人凝血因子Ⅷ，毕赤酵母，整合，发酵ABSTRACTHumancoagulationfactorVl(hFVl)playsanessentialroleinthehumancascadeofinternalcoagulation．AndthefactordefectcancausehemophiliaA．Currently,theprote

4、inreplacementtherapywhatisinputtingthepreparationscontaininghFVHa∞adoptedintheclinicaltreatmentofthisdisease．Intheworld,manypeoplegetthisdisease,about1／10000-3／10000．SotheonlywayofextractinghFVHfromtheplasmacallnotmeettherequirementofsuchalargenumbers．Therefore，usinggeneticengineeringmet

5、hodtoproducehFWundoubtedlyhavegreatcommercialvalue．ConsideringthestrongexpressionsystemofP．pastoris,thisresearchuseP．paator／sGSI5a8thehoststrain，andhavestudiedtheinitialfermentationconditionsafterobtainingthesecretory8trainwhichproducetherecombinanthumancoagulationfactorⅧ(rhFVZ)．’Thispap

6、erselectpPIC9secretoryexpressionvectortoconstructthestrain，andsuccessfullyobtaintherecombinantvectorpPIC9-FV!，whichislinesrize通bySailandintegrateintothechromosomeofGSll5byelectrotransformationinthenextstep．Then,谢tllthefollowingstepsofscreeningthepositiveclonesbygenomicPCR,selectingtheHis

7、+Mut+phenotypebyMMandMDplates，cultivatingthe只pastor／sintheBMGY／BMMYnutrientmediuminshakeflasksandidentificatingculturesupernatantbySDS-PAGE，thepositivestrainswhichCallexpressrhFV!arefinallyobtained．BytheresearchoftheexpressionpaRern，itisfoundthat，theexpressionlevelofthisp