乙型脑炎减毒活疫苗.doc

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1、乙型脑炎减毒活疫苗YixingNaoyanJianduHuoYimiaoJapaneseEncephalitisVaccine,Live本品系用乙型脑炎（简称乙脑）减毒株病毒接种于原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液、加入适宜稳定剂后冻干制成，用于预防乙型脑炎。1基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。2制造2.1生产用细胞生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。2．1．1细胞管理及检定应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。2.1.2细胞制

2、备选用10～14日龄清洁地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37±1℃培养。细胞生长成致密单层后接种病毒。来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批。源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。2.2毒种2.2.1名称及来源生产用毒种为乙脑病毒SA14-14-2减毒株。2.2.2种子批的建立应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。原始种子批传代应不超过第6代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第9代,生产的疫苗应不超过第1

3、0代。2.2.3种子批的检定主种子批应进行以下全面检定，工作种子批至少应进行2.2.3.1~2.2.3.4项检定。2.2.3.1鉴别试验取毒种做10倍系列稀释，取适宜稀释度分别与非同源性乙脑特异性抗体和乙脑阴性血清混合，置37℃作用90分钟，分别接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5～7天判定结果。中和指数应大于1000。2.2.3.2病毒滴定取毒种作10倍系列稀释，至少取3个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定。冻干种子批病毒滴度应不低于应5.7LgPFU/ml；液体种子批病毒滴度应

4、不低于7.2LgPFU/ml。2.2.3.3无菌检查依法检查（附录XIIA），应符合规定。2.2.3.4支原体检查依法检查（附录XIIB），应符合规定。2.2.3.5病毒外源因子检查依法检查（附录XIIC），应符合规定。2.2.3.6E蛋白基因稳定性试验以E蛋白基因区核苷酸序列测定验证其遗传稳定性。编码E蛋白基因区的8个关键位点氨基酸不能发生改变（E-107：苯丙氨酸,E-138：赖氨酸，E－176：缬氨酸，E－177：丙氨酸，E－264：组氨酸，E－279：蛋氨酸，E－315：缬氨酸，E－439：精氨酸）。与基因库中登

5、录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14－14－2株的E蛋白基因区核苷酸序列的同源性不低于99.6%。2.2.3.7免疫原性检查用主种子批制备疫苗，取10-3、10-4、10-5至少3个稀释度，分别免疫体重为10～12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P3株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3ml，其病毒量应不低于500腹腔滴定的LD50。同时每只小鼠脑内接种稀释液0.03ml。攻击后14天判定结果。ED50应不高于3.0LgPFU，攻击对照组小鼠死亡率应不低于80%。2.2.3.8猴体神经毒力

6、试验用冻干主种子批进行猴体神经毒力试验。将主种子批毒种（病毒滴度不低于5.7LgPFU/ml），分别注射10只恒河猴的两侧丘脑各0.5ml和腰部脊髓内0.2ml。对照组用强毒SA14株稀释成102PFU/ml和103PFU/ml病毒量,以同法接种猴子，每个稀释度注射4只猴子，注射部位同试验组。对SA14-14-2减毒株组的10只猴子观察至少21天，应无任何特异性乙脑发病症状，组织学检查仅表现为注射部位、脑和脊髓有轻微的炎症反应。而对照组SA14株在注射后8天内病毒量103PFU/ml组4只猴子应全部死亡；病毒量为102P

7、FU/ml组的4只猴子，至少应有2只猴子死亡。组织学检查表现主要特征为神经细胞坏死，较少炎症反应。2.2.3.9脑内致病力试验用种子批毒种接种体重为12～14g小鼠，至少10只，每只脑内注射0.03ml，观察14天应活存。接种后3天内死亡者不计，但3天内死亡数不得超过20%。3天后如有小鼠发病，应处死后取脑，测定致病力。小鼠脑内毒力应不高于3.0LgLD50/0.03ml，同时以10-1病鼠脑悬液皮下注射体重为10～12g小鼠10只，每只0.1ml，观察14天，应全部健存。2.2.3.10皮下感染入脑试验用种子批毒种接种

8、体重为10～12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应全部健存。2.2.3.11乳鼠传代返祖试验用病毒滴度不低于7.2LgPFU/ml(液体毒种)或不低于5.7PFU/ml(冻干毒种)的种子批毒种接种3～5日龄乳鼠10只，每只脑内注射0.02ml。将发病的乳鼠处死3只，解剖取脑，用体重