虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析.pdf

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1、第27卷第4期2012年8月大连海洋大学学报JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYV01．27No．4Aug．2012文章编号：2095—1388(2012)04—0294—06虾夷马粪海胆CYP51基因eDNA的克隆及其SNPs分析仇雪梅1、2，吴领知2，郭晓黎2，张伟杰1，丛玉婷2，常亚青1、2，宋坚1、2，刘洋2，王秀利2(1．大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023；2．大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023)摘要：采用RT—PCR、PCR—

2、SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆Strongylocentrotv,sin-termediusCYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析。结果表明：虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1491bp的开放阅读框，编码496个氨基酸；其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性，即核苷酸发生了A—G突变。关联分析结果表明，该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性(P<0．05)。本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的eDNA序列

3、并进行了SNPs分析，研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考。关键词：虾夷马粪海胆；CYP51基因；克隆；单核苷酸多态性中图分类号：$917文献标志码：A细胞色素P450基因家族编码的酶系在内源性物质(如激素)和外源性物质(如药物、环境化合物)的代谢过程中起着重要作用¨J。CYP51基因是P450超基因家族重要的成员，它是P450家族中唯一广泛分布于各种真核生物，甚至是一些原核生物中的成员[2-4]。CYP51基因编码的140r一去甲基酶是甾醇合成过程中的关键酶之一¨J。该酶的主要功能是催化甾

4、醇前体14a一甲基羟基化的反应，生成的终产物在动物中为胆固醇，在真菌中为麦酵素，在植物和原生动物中为多种24一烷基化和烯烃化甾醇M1。在哺乳动物体内，140r一去甲基酶的直接产物FF—MAS，不仅是胆固醇合成过程的中间产物，吏是被确定为促减数分裂甾醇(meiosis—aeti—vatingsterol，MAS)"1。减数分裂是动物有性繁殖过程中生成单倍体配子的关键步骤，因此，MAS在性腺中的合成、分布及其与单倍体配子生成的关系已经成为Cy尸51基因研究的一个热点。与其它物种相比，棘皮动物C蹦l基因的研究并

5、不是很深入。而对于海胆这种以性腺为主要经济性状的动物来说，生殖细胞形成、成熟过程的调控对性腺的发育分化，甚至整个个体生长发育的影响极有可能更为突出。虾夷马粪海胆Strongylocen．trotusintermedius又称中间球海胆，原产于日本北海道及俄罗斯萨哈林岛等地，因其性腺色泽好、味甜、经济价值高、国际市场需求量高，中国于1989年从日本引进了该品种。目前，虾夷马粪海胆已经成为中国重要的经济海胆之一，发展前景良好。本研究中作者首次克隆了虾夷马粪海胆的CYP51基因，并进行了该基因的单核苷酸多态性(

6、singlenucleotidepolymorphism，SNPs)与壳高、壳径、性腺质量、体质量等生长性状的关联性分析，为进一步明确CYP51基因的功能，以及为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考。1材料与方法1．1材料试验动物：虾夷马粪海胆由大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室提供，26月龄，共180个。主要试剂：rTaqDNA聚合酶、dNTPs、M—MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、PMDT一19载体、DNA切胶回收试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司；Trizol试剂盒购自美国Invit

7、rogen公司。收稿日期：2012—03—27基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目(20102043)；辽宁省“百千万人才工程”项目(2010921093)作者简介：仇雪梅(1964-)，女，博士，教授。E-mail：xmqiu@dlou．edu．cn；‘第4期仇雪梅，等：虾夷马粪海胆CYP51基因eDNA的克隆及其SNPs分析2951．2方法1。2．1生长性状的测定测定虾夷马粪海胆的壳高、壳径和体质量等生长性状后，取性腺，测定性腺质量，并将性腺迅速放人冰箱(一80℃)中保存。1．2．2总RNA的提取和e

8、DNA第一链的合成取虾夷马粪海胆性腺组织100mg，按照Tfizol总RNA提取试剂说明书所提供的方法进行总RNA的提取，并用15g／L的琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA。对提取的RNA，按照试剂盒说明书所提供的方法用M—MLV反转录酶和随机引物合成cDNA第一链。1．2．3虾夷马粪海胆性腺基因组的提取采用常规酚氯仿法抽提虾夷马粪海胆基因组DNA，用TE缓冲液溶解，并在4℃下保存。1．2．4引物合成和PCR扩增从美国国立生物技术