虾夷马粪海胆NLR家族基因片段的克隆及表达特征分析-论文.pdf

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1、第29卷第4期大连海洋大学学报V0l_29No．42014年8月JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYAug．2014DOI110．3969／J．ISSN．2095—1388．2014．04．003文章编号：2095—1388(2014)04—0336—06虾夷马粪海胆NLR家族基因片段的克隆及表达特征分析陈亚东，刘晓飞，常亚青，仇雪梅，王秀利，刘洋(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023)摘要：采用同源克隆和半定量RT—PCR方法，对虾夷马粪海胆StrongylocentrotusintermediusNLR家族基因片段进行了

2、克隆和组织表达特征分析。将紫球海胆s．purpuratus的9组NLR家族聚类的编码区序列进行比对后，根据保守区域设计引物扩增虾夷马粪海胆中相应的基因，通过测序获得了9组不同NLR聚类基因片段，每组各10个测序结果，通过基因序列及氨基酸序列比对分析，发现存在长度及序列结果上的差异，这说明每组NLR家族聚类都存在多个家族成员。同时选取虾夷马粪海胆的不同组织提取RNA，反转录后使用同样的引物进行半定量RT-PCR分析，结果表明，NLR基因在虾夷马粪海胆的管足、肠、围口膜、体腔细胞、性腺中存在高效表达，且在围口膜及性腺中表达量最高，表明NLR基因在虾夷马粪海胆中普遍表达，并存在表达

3、差异。研究表明，NLR基因在海胆免疫过程中起着重要作用。关键词：虾夷马粪海胆；NLR家族；半定量RT—PCR中图分类号：$917文献标志码：ANLR家族(thenucleotide—bindingdomainand表达IL-8、COX一2、IL一1p和抗菌肽等基因，进leucine-richrepeatcontaininggenefamily)属于模式行免疫反应，以达到保护机体不受外来病原菌侵扰识别受体的重要一员，同源于植物抗病R蛋的目的J。紫球海胆Strongylocentrotuspurpuratus基白，主要存在于细胞质内，识别进入细胞内的抗原因组内存在208个NLR家

4、族基因，种类比人类物质，包括细菌组分、肽聚糖和核酸等。目前NLR家族(20种)丰富得多9J。Hibino等叫对紫已经有多种NLR分子被发现，它们都具有保守的球海胆的NLR家族基因进行了聚类分析，并进一结构域：N端可变区域、中间保守的NBD(nude．步划分出9组亚类，也进行了初步的实时定量表达otide—bindingdomain)结构域和C端的LRR(1eu—分析。虾夷马粪海胆与紫球海胆基因组具有高度的cine—richrepeats)结构域。LRR结构域的主要作同源性，有关紫球海胆的NLR家族基因的研究结用是识别包括细菌及真菌的一些细胞组分、病毒的果可为研究虾夷马粪海胆N

5、LR家族基因提供参考。核酸等J。N端可变区域主要作用是和其他蛋白虾夷马粪海胆Strongylocentrotu~intermedi原结合，传递接收到的抗原信号，是效应区，但有一产于日本北海道及以北沿海，在俄罗斯远东地区的些NLR分子没有明显的N端结构域。N端可变萨哈林岛等地也有分布。大连海洋大学于1989年区域的不同变化对于NLR蛋白激活不同后续免疫将其从日本引入中国，现已成为中国北方沿海特别过程具有重要意义。NBD结构域是NLR分子多聚是辽东和山东半岛重要的养殖种类，养殖规模越来化所需要的结构。越大。海胆作为一种模式生物已经被广泛应用于基根据N端结构域的不同，NLR家族可分

6、为五础生物学研究。目前，对海胆生物学的研究主要集类：NLRA、NLRB、NLRC、NLRP和NLRX7J。这中在繁殖育苗卜J、饵料、疾病和营养等应用研些NLR家族蛋白分子位于细胞质内，识别特异的究，也有关于细胞学、分子标记¨和功能基微生物组分，最终激活NF—KB信号通路，再调控因克隆与分析u掩等基础研究，但对虾夷马粪海收稿日期：2013—11—10基金项目：国家自然科学基金资助项目(31101923)作者简介：陈亚东(1988一)，男，硕士研究生。E—mail：chenyadong3@163．tom通信作者：刘洋(1978一)，男，博士，副教授。E-mail：liuyang@

7、dlou．edtr121"1第4期陈亚东，等：虾夷马粪海胆NLR家族基因片段的克隆及表达特征分析337胆免疫系统分子水平的相关研究在国内尚未见报1．2．3NLR部分基因片段的扩增及回收测序虾道。NLR家族作为重要的免疫基因家族，其研究夷马粪海胆NLR基因片段扩增的PCR反应体系结果可以促进虾夷马粪海胆免疫系统分子机制的研(50L)：ddH2O36．5IxL；dNTP(各2．5mmol／L)究。本研究中克隆了虾夷马粪海胆NLR家族基因4汕L；10XTaqbufier5L；上、下游引物(10编码区的保守序列