华南地区猪群中葡萄球菌的分离鉴定及猪葡萄球菌EXHC毒素基因的原核表达.pdf

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1、分类号S859.7学校代码10129UDC11.220学号08201078华南地区猪群中葡萄球菌的分离鉴定及猪葡萄球菌EXHC毒素基因的原核表达IsolationandIdentificationofStaphylococcusfromPigsinSouthofChinaandProkaryoticExpressionofEXHCToxinsGeneofStaphylococcushyicus申请人：张乐宜学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物与免疫学指导教师：郝永清教授宋长绪研究

2、员论文提交日期：二〇一一年五月摘要猪渗出性皮炎是由葡萄球菌引起的一种以哺乳仔猪和刚断奶仔猪的急性或超急性接触性传染病，患病仔猪主要以渗出性，发热、脱水和死亡为主要临床特征，具有传播快、死亡率高等特点。该病严重影响仔猪的生长发育，给我国养殖业造成了较大的经济损失。本研究针对华南周边地区疑似患有渗出性皮炎的病猪进行了葡萄球菌的分离鉴定及分类；通过对筛选出的7株猪葡萄球菌脱落毒素基因的检测建立了脱落毒素基因的PCR检测方法；对鉴定出的EXHC基因进行了克隆和表达。1、通过镜检、生化鉴定初步分离到了16株

3、葡萄球菌；动物致病性试验中，猪葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、松鼠源葡萄球菌、产色葡萄球菌的试验组小鼠的死亡率分别为：100%，83.3%，66.7%，100%，16.7%，而模仿葡萄球菌、科氏葡萄球菌的实验组有没有死亡个体；药敏试验中这些菌株对头孢类、新生霉素等抗生素高度敏感，对青霉素类抗生素产生耐药性。2、参照葡萄球菌Gap(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenases,甘油醛-三磷酸脱氢酶)和16SrRNA基因的通用引物对初步鉴定出的16株葡萄球菌进

4、行了基因克隆和序列分析。Gap基因克隆测序结果在NCBI上进行Blast分析，分离的16株菌株可以归类为Staphylococcushyicus、Staphylococcusepidermidis、Staphylococcuschromogenes、Staphylococcussimulans、Staphylococcussciuri、Staphylococcuscohnii、Staphylococcushaemolyticus，其同源性分别为100%、99%、93%、100%、98%、96%、9

5、9%，以上分离到的7类菌种与不同亚种之间的同源性75.6～99%。16SrRNA基因克隆、序列比对分析显示葡萄球菌属的不同亚种之间核苷酸差异性不明显，同源性为92%以上。3、利用建立的PCR检测方法对分离的7株猪葡萄球菌进行脱落毒素基因的检测。结果显示SHETA的检出率为100%；EXHA的检出率为28.7%；EXHC、EXHB的检出率均为14.3%。4、对分离的GDZC株进行了Gap基因的克隆及序列分析，并对EXHC基因进行了克隆和表达。结果表明，该菌株Gap基因与Genbank已发表猪葡萄球菌

6、（AF495492）菌株的核苷酸同源性为99%；EXHC基因与Genbank上已发表的丹麦分离株(AF515455)核苷酸序列同源性为100%。将EXHC基因插入pET-28a(+)载体，经酶切和测序鉴定正确后，成功构建了pET-28a(+)-EXHC原核表达载体。关键词：葡萄球菌；猪葡萄球菌；渗出性皮炎；脱落毒素IsolationandIdentificationofStaphylococcusfromPigsinSouthofChinaandProkaryoticExpressionofEXH

7、CToxinsGeneofStaphylococcushyicusAbstractExudativedermatitisiscausedbystaphylococcuswithalactationpigletandjustweanedpigletsacuteorsuperacutecontactsexuallytransmitteddiseases,sickwithexudative,mainpigletsnecrotizingdermatitis,fever,dehydrationanddeat

8、hforcharacteristics,whichisspreadingfast,mortality,highercharacteristic,5-6day-oldpeakincidencepiglets.Thediseaseseriouslyaffectthegrowthanddevelopmentofpiglets,giveourbreedingcausedagreateconomiclosses.Inthisstudy,isolatedandidentifiedStaphyl