猪轮状病毒地方株的分离鉴定及其VP6基因的克隆与原核表达

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1、东北农业大学硕士学位论文猪轮状病毒地方株的分离鉴定及其VP6基因的克隆与原核表达姓名：陈淑红申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李一经2003.5.1摘要!!!自!!!!!!!自!!=§!!E!!!!!!#!!目$!!!g!!!目!!1511。要猪轮状病毒(PorcineRotavi,rus，PRv)是呼肠孤病毒科轮状病毒属的成员，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之～，给世界各地的畜牧业造成严重的经济损失。我国PRV感染也非常普遍，有些地区断奶仔猪阳性率高达72％。本实验从吉林省某猪场发生腹泻的猪群粪样中，用M

2、Al04细胞培养，分离到一株PRV，盲传至4代出现明显病变，经电镜观察见有典型的车轮状病毒颗粒。病毒核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)表明：其电泳型为4：2：3：2型，属于A群轮状病毒。这株病毒被命名为JL94。／采用双层法用MAl04细胞进行病毒蚀斑试验，JL94能形成大多数直径约lmm左右的蚀斑，大部分形状不规则，少部分呈圆形，镜下可见清晰的不着色区，此区由碎裂的死细胞团构成。采集人及9种动物的红细胞，用病毒的细胞培养物做血凝和血凝抑制试验，来检测JL94的血凝特性。血凝试验证明JL94不凝集鸡、鹅、猴、小白鼠

3、、豚鼠、山羊、狗、人的O型、A型及B型红细胞。对于兔、猪的红细胞集现象不稳定，有待于进～步确定。根据GenBank中的多株猪A群轮状病毒VP6蛋白完整基因序列，利用oli9041设计引物，以JL94RNA为模板，通过RT-PCR扩增出长约1．3kb的基因片段，命名为VP6。将其插入克隆载体质粒pMDl8-T的EcoKV酶切位点处，构建重组质粒pMDl8．T—vP6。对克隆的VP6基因进行序列测定，测序结果显示JL94VP6基因全长1356bp，含有完整的开放阅读框架，编码397个氮基酸。将其VP6序列与猪A群轮状病毒

4、代表株OSU(噩组I)、Gottfried(亚组II)的VP6进行同源比较，结果显示，核苷酸序列同源性分别为8685％、82．41％，氨基酸序列同源性分别为97．48％、93．20％，结果表明3-L94地方分离株与0SU株在基因型上更为接近。从重组质粒pMDl8-T_一VP6上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET．30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导以后表达出预计的45ku的融合蛋白，同时还有一些小的蛋白表达出来，光密度扫描对表达产物进行初步定量表明，45ku融合蛋白占菌体总蛋白的26．5％。表达产

5、物经Ni—NTA金属螯合层析柱纯化后，得到纯化的His．taggedVP6融合蛋白。采用Western-blot对表达产物及纯化产物进行反应原性分析，结果表明所得His-taggedVP6融合蛋白具有较好的抗原反应特异性。之，pL一本研究为国内PRV毒株鉴定、分子流行病学调查、分子诊断试剂的开发以及基因工程疫苗的研制提供了理论依据和物质基础。关键词猪轮状病毒；分离鉴定；VP6基因：克隆：原核表达、VIsolationandCharacterizationofPorcineRotavirusandItsVP6GeneC

6、loningandExpressioninEscherichiaColiAbstractPorcineRotavirus(PRV)belongstothefamilyreoviridae．Itisoneofthemajorpathogensofdiarrheainpigletsandcausesamajorhealthworldwideingraziery．InfectionofPRVisalsoprevalentinchina，insomeareatheinfectiousratioofpigletsis72％．A

7、ccuratediagnosisanderiectivevaccinationaremainmeansforthepreventionofPRVdiarrheaInthisstudy，porcinerotaviruswassuccessfullyisolatedfromdiarrhealpigletfecalsamplesfromJilinprovinceMA104cellswereusedforthereplicationandisolationofthevirus．Afterfourpassages，theiso

8、latecouldproduceobviouscytopahiceffects(CPE)．Typicalrotavirusparticleswereseenwithdirectelectronmicroscope．Polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)ofitsdsRNAgenomeshoweditsRNA