牛孤雌多倍体胚与克隆多倍体胚胎的研究.pdf

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1、分类号UDC论文题目密级10126编号至Q三!!Q!三研究生：自壹玲指导教师：趄旦王院±奎当鹏教援专业：动物堂2011年6月8日原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得凼墓直太堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部

2、分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。学位论文作者签名：鱼盔缝指导教师签名：日期：丛丛：笸：篮日期：塑丝笸：丝内蒙古大学博士学位论文牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究摘要在哺乳动物中，体细胞克隆胚胎能够发育成个体的成功率一直很低。即使能够发育到妊娠后期，也往往

3、出现胎儿巨大、胎盘异常等现象，从而影响克隆动物生产效率。多倍体细胞主要参与胎盘等胚外组织的形成，将多倍体胚胎与克隆胚胎聚合为一体进行移植，可以改善胎盘异常等引起的效率底下现象。因此，多倍体胚胎的研究对于进一步了解克隆动物发育机理具有重要意义。本研究采用免疫荧光染色、药物处理、孤雌激活、反向核移植等技术，研究了获得孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的技术途径、分析了卵母细胞核的存在对体细胞核重编程的影响，以便为进一步完善体细胞克隆技术提供实验依据。1、牛、山羊、、绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核和细胞骨架的动态学变化在牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中，收集成熟不同时间的细胞，通

4、过对纺锤体微管、微丝和染色体的免疫荧光染色，分析了在整个体外成熟过程中细胞核的成熟进程以及细胞骨架和染色体的动态变化。结果显示：牛和山羊卵母细胞在成熟培养后的4h开始发生GVBD，12h即有50％．60％的卵母细胞到达MI期，16h到达AI／TI期峰值(42％)，20h后牛和山羊分别有66％和84％的卵母细胞进入MII期；绵羊卵母细胞核成熟进程略慢于牛和山羊，GVBD发生的时间也是成熟培养后的4h，但达AI／TI期峰值的时间和发育为MII期的～，时间分别为20h(50％)和24h(76．5％)，均晚于牛和山羊；卵母细胞在体外”、成熟过程中，其细胞骨架和染色体动态变化在三种动物

5、基本相似，在部分绵羊⋯卵母细胞出现三级纺锤体等异常结构。．一鱼壹坠生亟些童堡堡墅堕：皇壅堕兰堡堡墅堕塑婴壅2、细胞松弛素B(CB)对牛卵母细胞减数分裂和二倍染色体卵母细胞形成的影响将牛卵母细胞置入含有CB的培养液中培养后，分别观察了CB的浓度和处理方法对卵母细胞发育的影响，其结果是：(1)培养时间24h(全程处理)，CB浓度≥2．0pg／ml时，卵母细胞的成熟率≤44．8％，成熟卵母细胞的染色体单倍性组成比例≤73．9％，两者均显著低于对照组的83．1％和93．8％；处理组有50％以上的卵母细胞未排出第一极体(PBl)，其中的50％．65％染色体为60条，呈二倍性；处理的卵母

6、细胞中出现纺锤体形态异常、两个纺锤体、60条染色体组成超大纺锤体等现象。(2)在培养时间6．8h分别添加7．5肛咖l和15／xg／ml的CB预处理，然后移到无CB的培养液中继续培养至24h，其结果卵母细胞的成熟率约为80％，与对照组的83％没有显著性差异，将预处理时间延长到10h使成熟率显著降低(60％)。(3)在未处理培养液中培养10h，然后转移至含有3．0．7．5}tg／mLCB的培养液中继续培养到24h(后处理)，结果只有41．5．7．2％的卵母细胞排出PBl，其余58．5．92．8％没有排除PBl。(4)在无CB的培养液中培养10h，然后移至含有7．5gg／mlCB的

7、培养液中分别培养至24h、30h、36h、48h，进行免疫荧光染色，观察卵母细胞所处核相，结果是30h以上处理组AI／TI期卵的比例为1．9—6．4％，显著低于24h处理组的15．3％，而多数为由60条染色体组成的巨大纺锤体细胞。以上结果表明，CB可能破坏纺锤体结构，从而抑制PBl排出，降低卵母细胞成熟率，导致二倍染色体(2n或4c)卵母细胞的形成。3、细胞松弛素B(CB)对牛四倍体孤雌胚胎发育的影响将卵母细胞分为三个处理组：一是CB浓度为o．1．10．0}．tg／ml，培养时间24h的处理组(全程处理