小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞多能性与功能的研究

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1、密级：保密期限：小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞多能性与功能的研究PluripotentandfunctionofParthenogenetichaploidembryonicstemcellsofmouse学号姓名学位类别学科专业指导教师完成时间答辩委员会主席签名D201102055何正泉理学硕士细胞生物学周琪2014年5月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特另tlDH以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽大学或其他教育机构的学位或

2、证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。厂学位论文作者签名：彳；『舌泉签字日期：矽卢年4月垆日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：行孑佩导师签名：』签字日期：舛卢年厂月夕日签字日期：乃【

3、F学位论文作者毕业去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要大多数生物包括人在内都是二倍体，即有两套染色体组，一套来源于父方，一套来源于母方。然而，对于基因研究来说，二倍体是巨大的困难，因为人们很难确定生物的某一性状是由哪一套染色体决定的，隐性基因表型难以在杂合中体现出来。而对于单倍体细胞，如白色链球菌、酵母等是遗传学研究的重要模型。在自然状态下对于哺乳动物而言，只存在结构和功能均已特化的单倍体配子，如卵子和精子。然而，卵子和精子在体外一般不能长期进行培养和扩增，因此难以对其进行基因方面的操作。在体外能建立哺乳动物的单倍体干细胞系，将有利于

4、促进哺乳动物发育、遗传和进化等相关生命科学研究。研究人员已经建立青鳟鱼的单倍体胚胎干细胞，它们只含有一套染色体组。这些新的单倍体干细胞能够用于快速地分析哺乳动物发育方面的基因调控网络。能用于正反向遗传筛选基因，能建立产生纯合子基因突变文库。2011年首次建立了哺乳动物孤雌单倍体胚胎干细胞系，这极大推动基因研究的进展。2012年我们研究组和李劲松研究组同时建立了孤雄单倍体胚胎干细胞系，证明了这些细胞保留一定的雄性印记，功能试验进一步验证这些细胞能够代替精子注入卵母细胞后可以产生健康的小鼠。为了探讨孤雌单倍体是否具有像孤雄单倍体替代精子一样替代

5、卵基因组支持胚胎发育。本实验首次探讨了小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞多能性及其功能。利用孤雌激活的方法获得孤雌单倍体细胞系，通过流式细胞分选技术能够很好维持其单倍性。核型分析和CGH杂交技术建立单倍体干细胞系能很好的保持基因组稳定性，染色体条数呈单倍性，基因拷贝数稳定。利用PiggyBac过表达技术，Cas9技术分别建立GFP、RFP等稳定过表达和基因敲除孤雌单倍体胚胎干细胞系，这些细胞系能长期稳定传代。建立的孤雌单倍体胚胎干细胞具有多能性。免疫荧光染色和RT．PCR分析显示孤雌单倍体表达Oct4、Nanog、SOX2、Klf4、SSEAl等多能

6、性Marker。全基因组表达谱分析建立小鼠孤雌单倍体基因表达模式相比较于MEF更接近二倍体ES。畸胎瘤实验验证小鼠孤雌单倍体能形成三胚层分化的畸胎瘤，二倍体嵌合实验证明单倍体孤雌胚胎干细胞像二倍体ES一样具有嵌合到身体各个脏器的能小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞多能性与功能的研究力，尽管都是以二倍化形式存在。有意思的是孤雌单倍体还能发生种系嵌合，能够将遗传操作遗传给下一代。孤雌单倍体胚胎干细胞具有母源印记，通过注入孤雄胚胎内能够支持胚胎发育到期，生成可育健康小鼠。尽管效率较低，但这首次验证了孤雌单倍体胚胎干细胞代替母源基因组支持胚胎发育。关键词：、

7、孤雌单倍体胚胎干细胞，多能性，种系嵌合，母源基因组，印记基因IIAbsU'actAbstractMostorganisms，includingpeople，arediploid．Therearetwosetsofchromosomes．onederivedfromthefatherandtheotherfromthemother．However,thediploidishugedifficultyforgeneticresearch，becauseitishardtojudgewhichsetofchromosomescontributet

8、hebiologicalcharacterandtoreflectrecessivegenephenotypewheninthehybrid．Whilethehaploidcel