单克隆抗体制备 (2).ppt

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1、单克隆抗体制备Monoclonalantibody单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个抗原决定簇的抗体。分三个阶段：（1）免疫Balb/c小鼠（2）建立筛选方法和程序（3）杂交瘤的生成一、动物免疫1Balb/c小鼠6-8周龄，25g左右，雌性较佳2免疫方法（1）首次腹腔免疫0.5ml抗原与福氏完全佐剂1：1的混和液，一般2-3只鼠（2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂（3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫3天后，去脾脏融合对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体程序依抗原性质而定。可溶性蛋白（提取或表达的蛋白）50-100

2、μg颗粒性蛋白（病毒）50-100μg细菌106CFU活细胞（哺乳动物细胞）105-7CFU活癌源细胞104-6CFU糖类（多糖、糖蛋白）100-200μg核酸100-200μg1在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以MEM培养基复苏，37℃CO2培养箱中培养2在对数生长期收获107-108CFU的SP2/0细胞3500g离心5min，弃上清4轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20mLMEM营养液中二、骨髓瘤细胞的培养注意要点：1如细胞外观不健康，或生长密度不好，应检测是否有支原体污染2一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免长期培养3融合的细

3、胞要处于对数生长期三、饲养细胞的制备1取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2将小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤4用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入小鼠腹腔5轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几次，将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞瓶内待用6将饲养细胞转至50mL离心管内，500g离心5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培养瓶内待用注意事项：1严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否则会造成污染3如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针

4、头的位置，重新吸取细胞液四、脾细胞的制备1取Balb/c小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2将小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔4小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液的培养皿内5用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾细胞分离出来6用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离心管中，沉降5min7将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心5min，弃上清，沉淀以20mLMEM培养基重悬注意事项：1严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心，不能撕裂或撕碎脾脏，更不

5、能将肠道撕破3如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，应选用备用小鼠的脾脏五、细胞融合及培养1以2：1混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细胞融合管中2在室温下500g离心10min，弃上清3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置37℃水浴4在60S内用巴氏吸管将0.8mL预热至37℃PEG1500缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次5在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至37℃的MEM培养基加至融合管中37℃水浴5min室温下500g离心10min，弃上清在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉淀悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加入HAT培养

6、基30mL，后加入10-15mL饲养细胞悬液9将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔2-3滴，约0.1-0.15mL10将细胞培养板置37℃饱和湿度的CO2培养箱中培养11培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观察细胞融合情况12培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2137-8天用HT培养基换液，全部换液1410-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里的抗体。注意事项：1脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在2：1—5：1最好2细胞融合是关键步骤，避免用力吸打3细胞融合后3天要注意检查是否污染，包括细菌和

7、真菌，一发现污染，要尽快弃去4换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸出或冲散六、杂交瘤细胞的筛选大约有10%的杂交瘤细胞能分泌抗体，而分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛选。筛选抗体分泌细胞有多种方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中间接ELISA应用最广。注意事项：1因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗体。如单用酶标记抗IgG抗体，则IgM类单抗就不能被筛选出来。2阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长满后，上清再检测一次3筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选特异单抗的方法

8、最好七、杂交瘤细胞克隆在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对细胞进行克隆。常用有