单克隆抗体制备.ppt

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1、实验研究的目的性—功能、形态、数量实验设计的科学性—全面、动态、鲜明、对应、对照实验方法的合理性—确切、先进实验原理的内涵性—意义、要点实验操作的规范性—准备、严格、准确、重复免疫血清和单克隆抗体的制备一、免疫血清的制备1.原理：机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人或动物体内后可被不同的B细胞克隆同时识别，经过一定时间，受刺激的B细胞克隆针对抗原表位的多少而产生相应的特异性抗体，每一抗原表位都能诱发相应B细胞克隆产生单克隆抗体，此获得的血清即为含多种单克隆抗体的混合物，称之为多克隆抗体免疫血清，简称免疫血清。优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和

2、免疫原性，以及动物的免疫应答能力。此外，尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔和有无佐剂等因素。免疫原1.抗原种类微生物抗原、组织抗原和免疫球蛋白抗原。2.抗原纯度一般的抗原只要达到亲合层析或SDS－PAGE电泳纯即可。3.抗原用量在一定范围内与免疫应答强度呈正相关。在应用完全弗氏佐剂时，蛋白质类抗原剂量以0.5～1mg/kg体重为宜，加强免疫约为基础剂量的1/2～1/3。4.抗原的处理1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml为宜。2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌可溶性抗原组分等，可以直接

3、与弗氏完全佐剂（1：1V/V）混合、乳化。3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联剂。佐剂1.概念佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应答的类型。2.种类1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂多糖（LPS）、细胞因子；2）氢氧化铝、明矾；3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（polyI：C）和双链多聚腺苷酸：鸟苷酸（polyA：U）；

4、4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物（ISCOMs）、CPG寡核苷酸。3.弗氏完全佐剂1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。2）配方：羊毛脂：液体石蜡为1：2，也可1：1。灭活卡介苗（2～20mg/ml）。4.弗氏不完全佐剂，成分不含卡介苗，其他同弗氏佐剂。5.用法：佐剂与抗原等量混合，充分乳化。动物选择对免疫动物的主要要求有：1.应选择与抗原物质亲缘关系远的动物，特别是在制备抗免疫球蛋白血清时更要注意。抗原物质的来源生物与被免疫动物亲缘关系越远，免疫应答能力越强，抗体产生水平越高，抗体亲和力也越强。2.动物生理状态正常，发育成熟，体重符合规定。家兔初始免疫体

5、重通常在2～2.5kg。3.性别上以雄性成年动物较常用，也可采用雌性非妊娠动物。不能应用患病或刚刚病愈、有免疫缺陷或应用免疫抑制剂的动物。免疫方法1.免疫途径1）注射方法：静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内和淋巴结等。2）免疫方法：小剂量、多点、多途径方法。3）颗粒性抗原（细菌悬液、红细胞悬液）采用小鼠腹腔注射。4）可溶性抗原（如IgG）采用弗氏完全佐剂的乳剂（油包水型），家兔背部多点皮下注射法。2.可溶性抗原免疫1）方法：基础免疫（初次免疫）后三周左右，进行加强免疫，以后每隔2周加强免疫一次。2）加强免疫次数取决于试血结果。家兔耳缘静脉、小鼠眶静脉少量采血，分离血

6、清，免疫双扩实验测定血清效价>1：32或ELISA法测定抗体效价>1：10000，表明抗体效价较高，可采兔颈动脉或心脏全部血液，分离血清。4）如抗体效价较低，继续加强免疫，一般需4～5次。若仍不能达到抗体效价要求，应考虑重新免疫。3.颗粒性抗原免疫第一周注射2次，随后每周加强免疫1次，4～5天试血。3.操作程序1）健康雄性家兔体重2.5～3kg，背部皮下多点注射。2）基础免疫：抗原＋完全佐剂(抗原剂量4mg/只)2ml(1:1V/V)吸入两支注射器内，三通连接，反复推拉混合至乳化悬液。3）加强免疫：抗原＋不完全佐剂(抗原剂量2.5mg/只)，间隔7～10天加强

7、一次。约2～3次。4）试血：末次注射后第7天取少量静脉血，免疫双扩试验血清检测，抗血清效价1：32（或ELISA法检测抗体效价1：10，000）时颈动脉放血，分离血清，分装，保存。二单克隆抗体的制备1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，这项技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度准确的新纪元。1.原理根据致敏的单一B细胞克隆具有分泌特异性抗体和骨髓瘤细胞在体外长期增殖的特性，采用细胞融合技术在体外可将上述两种细胞融合形成杂

8、交瘤细胞。杂交瘤细胞因具备了B细胞和骨