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1、蒽酮比色法快速测定葡萄糖、果糖、蔗糖及淀粉含量蒽酮试剂与碳水化合物生成一种蓝绿色物质,是糖类特有的反应。不经分离而进行系统测定葡萄糖、果糖、蔗糖及淀粉含量基于以下三点:第一在室温下葡萄糖与蒽酮试剂不显色,此温度下果糖显色5min的吸收值与果糖在100℃显色5min吸收值几乎相等。第二稀碱与糖溶液共热时,可破坏葡萄糖、果糖,而蔗糖不被破坏。第三淀粉经酸水解后与蒽酮试剂显色。(二)试剂(1)蒽酮试剂:称0.4g蒽酮溶于100ml88%硫酸中(约84份体积97%浓硫酸与16份体积水混合,密封在磨口瓶中)。溶解后置水中冷却备用。此液当天配制。(2)2mol
2、/L氢氧化钾溶液。(3)3mol/L盐酸溶液(5)标准糖贮备液:精确称取250mg干燥的分析纯的糖(葡萄糖、果糖、蔗糖),分另移至250ml容量瓶中,配成1mg/ml浓度溶液。溶剂用蒸馏水和75%乙醇均可。(6)标准糖工作液:用移液管吸取10ml标准糖贮备液于100ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度、摇匀。此液含糖为100μg/ml。(三)测定步骤1.工作曲线绘制用2ml吸量管按表取标准糖工作液(葡萄糖不多于160μg,果糖不多于80μg,蔗糖不多于100μg)于干洁的试管(16×180mm)中,用蒸馏水分别调整其体积为2.0ml。从滴定管中加入蒽酮
3、试剂6.0ml。摇匀并立即置于沸水浴中加热5min,取出立即在冷水中迅速冷却(不断摇动)。用2.0ml蒸馏水重复上述操作,作为空白溶液。在分光光度计中,以640nm波长测定它们的消光度。以消光度为纵坐标,糖含量为横坐标,绘制标准工作曲线葡萄糖(G)体积/ml0.00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水体积/ml2.01.81.61.41.21.00.80.60.4葡萄糖(G)含量/ml020406080100120140160果糖(F)体积/ml0.00.10.20.30.40.50.60.70.8蒸馏水体积/ml2.01.91.8
4、1.71.61.51.41.31.2果糖(F)含量/ml01020304050607080蔗糖(S)体积/ml0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0蒸馏水体积/ml2.01.91.81.71.61.51.41.31.21.11.0蔗糖(S)含量/ml0102030405060708090100S102030405060708090G或F5.310.515.821.126.331.636.942.147.4S1.02.03.04.05.06.07.08.09.0G或F0.51.11.62.12.63.23.74.24.7S
5、0.10.20.30.40.50.60.70.80.9G或F0.050.110.160.210.260.320.370.420.472.样品中糖的提取谷物或植株体烘干、粉碎。精确称取烘干样品(谷物0.2g、植株体0.1g左右)放入研钵中,加加5ml蒸馏水磨至均匀,以5ml蒸馏水将均匀物全部移入离心管中,离心(3000r/min)5min。离心液倒入干净试管中。再向盛有沉淀的离心管加5ml蒸馏水并搅拌沉淀物,离心(重复二次),合并离心液于50ml容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度。此液用干葡萄糖、果糖及蔗糖的测定(A液)。以10ml3mol/L盐酸将离心管
6、中沉淀物全部转移到容量瓶中,盖上玻塞,放在沸水浴中煮沸40～45min,取出冷却至室温,加3mol/L氢氧化钠溶液10ml中和其酸性,以蒸馏水定容至50ml,从中取2ml溶液,加蒸馏水至50ml,混匀。此液用用淀粉的测定(B液)。3.蔗糖的测定精确吸取样品液(A)10ml,加入2mol/L氢氧化钾溶液2ml,置沸水浴中煮沸10min。取出迅速冷至室温,加蒸馏水稀释至50ml,摇匀。精确吸取稀释液2ml至一干净试管中,按标准曲线绘制步骤加蒽酮试剂显色测定,得光密度值E蔗。4.蔗糖的结果计算从蔗糖工作曲线求得蔗糖量为S(μg),按下式计算样品中蔗糖百分
7、含量。式中:S──待测样品液中蔗糖量(μg)W──样品称重(g)V1──用于测定的样品稀释液的体积(ml)V2──用于分析的样品稀释液总体积(ml)V3──样品液总体积(ml)V4──用于氢氧化钾水解的样品液体积(ml)5.葡萄糖、果糖的测定取样品液(A)10ml加蒸馏水至50ml,往两支干净试管中分别加入2ml样品稀释液其中一支加蒽酮试剂6ml,摇匀,在沸水浴中煮沸5分钟,取出立即浸入自来水冷却至室温,在640nm下测定光密度E100。另一支试管,加蒽酮试剂6ml,摇匀,在常温下显色5min,同上述操作测定光密度E常温。由E常温查果糖工作曲线求得
8、样品液果糖量为F(μg),按下式计算样品中果糖、葡萄糖含量。6.果糖、葡萄糖的结果计算由E100-E常温查葡萄糖工作曲线求
