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《分析化学实验报告4.蛋白质微量凯氏定氮法-2013-1008.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、蛋白质浓度测定——微量凯氏定氮法一目的:学习蛋白质微量凯氏定氮法的原理及操作技术。二原理:天然有机物(蛋白质等)的含氮总量,通常用微量凯氏定氮法来测定。该法是利用一般蛋白质含氮量平均在16%,将测得的含氮量折算成样品中的蛋白质含量。样品在凯氏烧瓶中经硫酸消化后,蛋白质分解产生氨,氨与硫酸作用生成硫酸铵,分解反应进行很慢,需加入催化剂(HgO),加K2S04以提高溶液的沸点,加入H202可加速反应。消化完后,在凯氏定氮仪中,加入强碱碱化消化液使硫酸铵分解,放出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨收集于过量的硼酸溶液中,以标
2、准酸滴定,根据标准酸消耗的量,乘以一定系数,即可计算样品中蛋白质的氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:三器材50ml凯氏烧瓶,50ml锥形瓶,1~2ml移液管,10ml量筒,表面皿,10ml酸式滴定管,滴定台,漏斗架,万用电炉,微量凯氏定氮仪,电热套。四试剂及样品(1)40%NaOH-5%Na2S2O3溶液;(2)混合指示剂:0.04%甲基红-60%乙醇指示剂溶液;(3)2%硼酸溶液;(4)0.01N盐酸标准溶液;(5)酱油(20ul)、维他奶(100ul)样品。(6)标准硫酸铵溶液(0.3mg/mL氮)
3、五操作方法(1)消化:取酱油(20ul)、维他奶(100ul),分别放入50ml凯氏烧瓶中,加入粉状硫酸钾约2.25g,黄色HgO20mg,硫酸1.5ml,摇动烧瓶,使全部样品浸没于硫酸内,将烧瓶置于电炉上,在通风橱内加热至量样品中有机物全部破坏,停止加热,放冷,加2滴H202,继续消化10min(颜色由黑变透明)。同时消化1份空白烧瓶。(2)溶解消化液:冷后(约10分钟),向每个盛有消化液的凯氏烧瓶加蒸馏水10ml,加热溶解,备用。(3)蒸馏和滴定安装好凯氏定氮装置,在水蒸汽发生器内装入蒸馏水至2/3体积
4、处,加入硫酸lmL,甲基红指示剂2~3滴,少许沸石,毛细管数支,接通电热套的电源,加热,用产生的水蒸气冲洗全套仪器,至馏出液不显酸碱性。从进样杯中分别加入lml标准(NH4)2SO4溶液、样品液、空白液,用少量蒸馏水洗3次凯氏烧瓶,塞好小玻塞。量取2%硼酸-混合指示剂溶液10mL于锥形瓶(接收瓶)中,置于冷凝管下端,不要留下空隙。注入10ml40%Na0H~5%Na2S2O3碱液到进样杯中,小心提起玻塞,慢慢放入碱液,当碱液流剩少许时,塞下小玻塞(防止NH3逸出),此时碱液与消化液呈黑色。10ml水分3次注
5、入进样杯,操作同上,目的是尽量把碱液冲下去。立即塞紧棒状玻塞,并加入少量蒸馏水,水封进样杯口,以防漏气。关闭排液管,开始蒸馏,让其反应至指示剂在5分钟内变色,自变色起蒸馏5分钟,溶液从粉色→绿色,到时间后,冷凝管下端移离指示剂液面,继续蒸馏1分钟,用蒸馏水冲洗冷凝管下端出口,锥瓶口以表面皿复盖待滴定。用标准盐酸滴定至终点(淡粉色)。本实验成功的关键:A.清洗干净反应室;B.加样时放松排液夹;C.加碱时保持密闭状态;D.用硼酸指示剂接收氨,下口全泡入液中;E.蒸馏时夹紧排液夹。F.滴定准确。注意事项:(1)在
6、整个测定过程中,应该避免周围环境里氨的影响,以确保结果的稳定。(2)若消化液未冷却便加水,可使硫酸爆沸或消化瓶爆裂,很危险!若水不纯,含OH-,可使无色透明之消化液变色,黄褐或黑色。六.计算1)标准硫酸铵氮含量的计算:标A为滴定样品用去的盐酸平均ml数;NHCL为盐酸的质量浓度等于0.0100mol/L;14为氮的原子量(1ml0.Olmol/L盐酸相当于0.14mg氮);2)样品氮及蛋白质的质量浓度的计算:①样品氮的质量浓度的计算:式样品中:A为滴定样品用去的盐酸平均ml数;B为滴定空白用去的盐酸平均m1
7、数;0.0100为盐酸的浓度(mol/L);n为样品的稀释倍数。14为氮的原子量(1ml0.Olmol/L盐酸相当于0.14mg氮);V为样品ml数。②蛋白质的质量浓度的计算:样品中蛋白质含量(mg/ml)=蛋白氮×NN为不同样品的蛋白质换算系数,一般均按蛋白质含氮量16%计算,即100/16=6.25,需要比较准确的计算时,应采用不同的换算系数。如七.思考题:1.测定标准硫酸铵和空白的目的分别是什麽?2.小结本人实验中的经验教训。
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