细胞生物学实验-——步骤集课件.ppt

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1、细胞生物学实验——步骤集PEG促细胞融合法的步骤（1）取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液。（可在4℃保存）（2）取(1)1ml+4ml0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理：①.1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）②.1000~1200r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液）③.1000~1200r/min离心7分钟。（3）将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1~0.2ml），

2、加入GKN液至1~2ml，使之成10%的细胞悬液。（4）取上述10%的血球悬液1ml，加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000000个，即。（5）取（4）1ml+0.5ml50%的PEG液，或取（4）0.5ml+0.5ml50%的PEG液，或取（4）0.5ml+1.0ml50%的PEG液，混匀滴片，在常温下2~3分钟后，镜下观察。【细胞凝集反应实验步骤】1.取土豆去皮块茎2克，加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。2.抽取兔子静脉血（加抗凝剂）1ml，加生理盐水3ml，在

3、1000r/min条件下，离心5分钟。重复三次离心，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液。3．分别用滴管吸取土豆凝集素和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片的左孔内，充分混匀。4．同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔内，充分混匀，作对照实验。5.摇晃5-10分钟后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。实验步骤—苏丹Ⅲ染色法断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，并在其下部置一载玻片，用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下，滴加甲醛钙于有标本

4、的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。用苏丹Ⅲ染色30分钟。吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，显微镜观察。原代细胞(脾细胞）培养步骤1.取材：取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿中，待用。2．分离脾细胞：用滴管先向

5、上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1～2分钟。吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000转/分离心1～2分钟。3．培养脾细胞：超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。取上述离心后的E

6、ppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞生死状态的鉴别——台盼蓝（TrypanBlue）法（1）试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。（2）细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化

7、液l～2ml,静置3～5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。（3）染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。（4）染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。或者，（3）染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2～5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使

8、小室内有气泡产生，否则要重新滴加。在普通光镜10X物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。（4）根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：II.伊红Y（EosinY）法（1）试剂配制：用生理盐水配制0.15%伊红染液，备用。（2）细胞悬液制备：将生长有悬浮型细胞的培养瓶（皿）稍微倾