基于CHO细胞的单抗生产2.ppt

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1、基于CHO细胞的单抗生产（第一版）2018/02CHO细胞的构建CHO细胞的表达CHO细胞表达后的产物纯化目录2021/7/282提高原料药出料工序收率第一节CHO细胞的构建2021/7/283生物类似药的开发周期表引言工程细胞构建的流程概述2021/7/285细胞株筛选一般流程宿主细胞载体筛选CHO细胞系宿主的一般来源FUT8（α-1,6岩藻糖转移酶基因），负责将岩藻糖加入抗体的N-糖链上，形成岩藻糖修饰（专利日本BioWa制药，预计2028.07.09）。去除岩藻糖修饰可以增强百倍以上的ADCC作用。2.crispr/ca

2、s9原理是：crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（singleguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。3.锌指核糖核酸酶（ZFN）由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。宿主细胞选择的一般原则Regulatory-HostcelllineI

3、ND提供CHO已知具有明显的致瘤性，一般可不再检测宿主细胞选择的一般原则载体的一般性构成主要构件：IRES起始位点Promoters启动子Enhancer增强子Signalpeptide信号肽mAbSequence单克隆抗体序列Terminator终止子Resistance markers抗性标记Expressionpromotingelement促稳定表达件载体的一般性构成1、IRES：即内部核糖体进入位点，是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5‘帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能

4、。通常来讲，真核生物翻译只能从mRNA的5‘端开始，因为翻译起始必须依赖于5’端的帽子结构。2、Promoters：即启动子，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子（transcriptionfactor）的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的抗体序列需使用强启动子如SV40启动子等而抗性基因需要使用削弱的启动子3、Enhancer：即增强子，是指能够使基因转录频率明显增加的DNA序列。增强子主要存在于真核生物基因组中。增强子能大大增强启动子的活性。增强子具

5、有特异性载体的一般性构成4、Signalpeptide：即信号肽（引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链）不同的产物可能需要不同的信号肽，抗体一般可使用人血白蛋白信号肽，获得较高表达量，且能被完全切除一般需要进行信号肽预测优化，选择合适的信号肽，在蛋白质分泌到胞外之前正常情况下会被完全切除信号肽假说认为，信号肽的功能是引导多肽到达内质网内腔，同时信号肽酶水解，加工完成后分泌到胞外5、mAbSequence人源化IgG1恒定区（CH和CL）有EM和DL两个版本，区别是两个位点的氨基酸有突变Biosimilar:检索原研药专利获

6、得VH和VL序列，并购买原研药进行序列分析比对，进行序列验证Category 1 of Therapeutic Biological Products:①Hybridomatechnique杂交瘤筛选②Phagedisplay噬菌体展示载体的一般性构成6、Terminator：终止子，是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。7、Expressionpromotingelement:即促表达元件例：UCOE:全称为泛染色质开放元件（UbiquitousChromat

7、inOpeningElement），加在外源基因启动子5’端上游，是一个小的DNA片段，源于看家基因的无甲基化CpG岛。研究表明，UCOE能有效防止基因沉默，不论整合到染色质什么位置，目的基因都能持续稳定、高水平地表达。MerckKGaA专利，预计2019.07.20到期载体的构建的一般性原则构建完的细胞筛选非扩增基因扩增基因：在一定程度上表达量随筛选压力而增加可选其中一种或选其中任意两种，使用两种需要关注HC和LC比例（LC形成二聚体可以分泌到胞外）筛选方法Fluorescence-ActivatedCellSorting(

8、FACS)-BasedScreening基于荧光激活细胞分选(FACS)技术的筛选方法ClonePix/CellXpressTM克隆筛选及细胞表达系统Limitingdilution有限稀释法筛选方法Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS