分子标记-RAPD和ISSR课件.ppt

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1、分子标记技术----RAPD-PCR、ISSR-PCR王春玲指导老师：王慧中应奇才分子标记概述分子标记是遗传标记中非常重要的一种，它是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。优点：它直接以DNA形式出现，不受限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；分子标记类型现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。一、基于分子杂交的分子标记　　这类标记利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用特异探针进行杂交，通过放射性自显影或

2、非同位素显色技术揭示DNA的多态性。（一）限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）（二）小卫星DNA（MinisatelliteDNA）二、基于PCR技术的分子标记随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD）、简单重复序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)、扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP)、ISSR（inter-simplesequencerepeat）（1）随机扩增多态性DNA（Rand

3、omAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD）RAPD是由Williams和Welsh（1990）同时发展起来的一项新的建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的遗传标记技术。基本原理该技术利用大量的、各不相同的，碱基顺序随机排列的寡聚单核苷酸链为引物(约8～10个碱基)，以待研究的基因组DNA片段为模板，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，可对基因组DNA进行多态性分析。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA）RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，这些特异的结合位点在基因组某

4、些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片段。一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。若位点2处碱基发生改变，则RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）DNA样品需要量少，

5、引物价格便宜，成本较低；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。RAPD已在遗传图谱构建、种质资源分析、基因标记等方面得到了广泛的应用。实验试剂随机引物（5μM）Taq酶10×PCRBufferdNTP10mMPCR体系ddH2O16μl10×PCRBuffer2.5μlMgCl22μldNTP(10mM)2μlPrimer(5pM)1μlTaq酶(2U/μl)0.5μlDNA(50ng)1μlTOTAL25μl最后加一滴石蜡油密封，防止体系蒸发。PCR程序94℃预变性2min40cy

6、cles94℃变性1min36℃复性1min72℃延伸1min72℃延伸10min10℃保存取PCR产物加1.5μlloadingbuffer，在2%琼脂糖凝胶电泳，100V稳压1小时。电泳结束以后，拍照、观察。RAPD引物Ｓ４８对部分兰属物种的扩增电泳图片RAPD-PCR扩增结果ISSR(inter-simplesequencerepeat)ISSR即简单序列重复间区是Zietkeiwitcz等于1994年在微卫星技术基础上发展起来的一种新的分子标记。基本原理真核生物广泛存在简单重复序列（simplesequencerepeat，SSR），如（AT）n（GAC）n等。利用SSR设计引物，

7、并在引物的的3‘端或5’端加上2-4个随机核甘酸，以保证引物与基因组DNA中SSR的3‘端或5’端结合，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。用来检测两个SSR之间的一段短DNA序列的差异。所扩增的两个SSR区域之间的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。由于微卫星在基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而可以检测到高的多