DNA甲基化检测技术全攻略.pdf

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1、DNA甲基化检测技术全攻略近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylationprofiling)。下面大家介绍一些常用的方法。特异位点的甲基化检测甲基化特异性PCR(MS-PCR)这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在

2、甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。亚硫酸氢盐处理+测序这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克

3、隆测序，过程较为繁琐、昂贵。联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstUI能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基

4、化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。荧光定量法(Methylight)此种方法利用TaqMan®探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTectMethyLightPCRKit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有F

5、AM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC标记的亚硫酸氢盐转化的未甲化的DNA特异的TaqMan探针能与目标序列杂交。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号。信号强度与PCR产物的量成正比，据此可计算出样品的甲基化程度。甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现，因为甲基化DNA含有更多的GC，相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的变化，可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技术可检出极微小的差别。使用这种方法进行甲基化分

6、析仅需一对引物，相比以往的方法更加快捷、简便和精确。不过对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪。目前市场上有多款PCR仪可满足要求，包括Illumina的Eco、QIAGEN的Rotor-GeneQ、罗氏LightCycler480等。焦磷酸测序焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。通过准确定量单个连续的CpG位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量

7、来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。QIAGEN目前提供三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMarkQ24的强项在于可对多达24个样品进行焦磷酸测序。需要大样品量的应用更适合在PyroMarkQ96ID上进行。在考虑到处理成百上千个样品所需的大量试剂时，运行通量最大化可能会使实验成本变得很高。而PyroMarkQ96MD装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行准确测序。为配合焦磷酸测序，QIAG

8、EN还推出了PyroMarkCpGAssays。这些预设计的甲基化