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1、特定DNA片段甲基化检测方法周慧敏哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG
2、岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。DNA的甲基化修饰，指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团，形成5甲基胞嘧啶。由于甲基基团很小，对其研究具有一定的难度。一般而言，可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种：a、甲基化敏感性内切酶；b、亚硫酸氢盐的修饰；c、特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白；d、质谱或色谱等精密检测手段。由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。甲基化检测方法分为两类,甲基化分型(methylationtyping)和甲基化图谱(methylati
3、onprofiling),后者又被称为甲基化组学(methylome)。甲基化分型技术通常应用于较少位点的检测,多为单基因的甲基化检测。甲基化图谱则是对大范围的基因甚至是全基因组的甲基化分析。一、甲基化分型绝大多数的DNA甲基化分型均基于聚合酶链反应(PCR)的方法,使用亚硫酸氢钠处理过的DNA作为模板。PCR引物设计上通常存在2种策略:甲基化非依赖性PCR(methylation?independentPCR,MIP)引物:甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)引物。（1）甲基化特异性PCR(methylation2specificPCR
4、,MSPCR)该法是检测基因组DNA甲基化水平的一种常用方法,原理是DNA经亚硫酸氢钠处理后,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时,有两套不同的引物对:其一引物序列来自经处理后的甲基化DNA链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物来自经处理后的非甲基化DNA链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,与未经处理的DNA序列无互补配对。MSPCR是一种快速检测方法,只需极少量的DNA用于分析。不足之处在于:①引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;②如果亚硫酸氢钠对DNA处理
5、不完全,也易导致假阳性;③MSP法是以引物中所有CpG位点胞嘧啶均甲基化为前提设计的,而事实上甲基化的CpG岛中却并非每个CpG位点都完全甲基化,所以,MSP法常常存在目标片段难扩增,或者特异性差等问题,不能反映整个CpG岛甲基化状态的缺陷。中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作,发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA甲基化分析方法.通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16基因启动子区特异CpG位点的甲基化状态(原理见图1).该技术具有较高的灵敏度和特异性,引物无需荧光标记,检测在均相溶液中进行,无需分离、纯化手段,而且与高通量分析兼容,在
6、癌症临床诊断上具有潜在的应用价值。共轭聚合物具有强的光捕获能力,具有倍增光学响应性,可用来放大荧光传感信号,为生物传感器的发展提供了新的传感模式.甲基化非依赖性PCR(methylation?independentPCR,MIP)引物:结合亚硫酸盐的限制性内切酶分析:使用限制性酶消化PCR产物后区分甲基化和未甲基化的DNA。用亚硫酸盐修饰后,甲基化和未甲基化的DNA测序的差异可以导致新的甲基化依赖的限制性位点的产生,Xiong等发展的联合亚硫酸盐限制性分析，通过将琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳产物消化后杂交分析,可定量检测甲基化位点。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因
7、此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能；由于酶和PCR的使用，序列分析受到限制。（二）甲基化图谱高效液相层析及相关方法高效液相层析(highperformanceliquidchromatography,HPLC)能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将DNA样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法(highperformancecapill
