实验八.SDS-PAGE测定蛋白质分子量.ppt

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量实验目的学习PAGE分离蛋白质的原理学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。一.PAGE分离蛋白质的原理PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具

2、有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。聚丙烯酰胺凝胶电泳--PAGE(Polyacryamidegelelectrophoresis)以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如电荷、分子量、等电点及分子构型。聚丙烯酰胺凝胶的合成丙稀酰胺聚丙烯酰胺凝胶催化剂聚合反应聚丙烯酰胺凝胶的三维网状结构稀溶液浓溶液－－交联剂凝胶－－结点T=X100%a+bmC=x100ba+bC=6.5-0.3T配制凝胶浓度计算及经验公式凝胶浓度的计算

3、聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是：上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。）聚丙烯酰胺的聚合及影响因素①化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲级乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。丙稀酰胺由

4、过硫酸铵（AP）在碱性条件下产生游离氧自由基引发单体丙稀酰胺成为自由基状态而成的。在碱性PH时，反应速率迅速；而在酸性条件时，同样浓度溶液，聚合速率减慢。在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在25℃聚合的凝胶则较透明和有弹性。分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合，O2使过硫酸铵（AP）分解。故在做胶后常要用水进行封闭；金属离子也干扰凝胶的化学聚合。②光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的O2条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。用量少，不会对样品有任何

5、不良的干扰现象；故常用于样品胶的聚合；聚合的时间可以自由控制缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好；光聚合适合大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合各种凝胶的聚合。核黄素B1还原型游离基聚合反应光照O2聚丙烯酰胺凝胶的孔径和分子筛效应凝胶是具有高粘度、高摩擦阻力的支持介质，能起到防止对流，把扩散减到最小，而且能影响大分子颗粒的移动过程。大分子在凝胶中的分离是受其所带的电荷、尺寸、和形状因素的影响．凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Sizesievingcapacity），故将此现象称为分子筛效

6、应（Molecularsievingeffect）.有效孔径取决于凝胶的总浓度T％，孔径随着T%的增加而减小。甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，有效孔径最小；T=5%时，甲基双丙稀酰胺的浓度为5%时，孔径为20nm。T是凝胶溶质的总百分浓度，C是与总浓度相关的交联百分浓度。故T是决定C，分离物的分子量的大小又决定了T的浓度。579111315T%AB凝胶浓度T对样品迁移率的影响例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T＝5％时，电泳行为主要以电荷起作用，B迁移速度快。当T增加，分子筛效应增加，B的迁移

7、速度减慢；T＝9％时，A，B的迁移率相同，不能分开，T再增加，凝胶孔径更小，A分子比B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。迁移率不连续凝胶电泳（disc）的分离原理(一).原理不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的①电荷效应分离外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。碱性不连续－分离酸性

8、样品不连续凝胶电泳洗脱酸性不连续－分离碱性样品大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。①.浓缩效应1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀）T＜5％，分离胶一般为小孔径（浓）T﹥7.5％。样品在较稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏，所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子量的大小进行电泳分离。2.缓冲液的组成:图示。PH系统的不连续