实验十七蛋白质分子量测定

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1、实验十七蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法一、目的：（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。（2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。二、原理：凝胶层析法（即凝胶过滤法，gelfiltration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecularsievechromatography），排阻层析法（exclusionchromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小

2、颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarosegel，商品名Sepharose），人

3、工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（tota

4、lvolume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即：Vt=Vo+Vi+VgVo称为“孔隙体积”或“外体积”（outervolume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（innervolume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此Vt—Vo等于Vi+Vg。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积（Ve，elutionVolume）

5、与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：Kd=上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-

6、2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。以上关系可用图17-4表示。Kd可以有下列几种情况：1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积（图中组分Ⅰ）。2、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和（图中组分Ⅲ）。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都

7、等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们既使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3、当0＜Kd＜1时，Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Ve即在Vo+Vi之间变化（图中组分Ⅱ）。4、有时Kd＞1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve＞Vo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd＞1。如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分别为1.2，1.4和2.2

8、。在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分