实验二蛋白质分子量的测定

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1、实验二蛋白质分子量的测定一一凝胶层析法一、原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分了筛，它可以把分了按大小不同的进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开来一•样。但是这种“过筛”与普通过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂屮浸，使充分洗液膨胀,然后装入层析柱屮，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而言凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，而使样品分了不同的分了得到分离。凝胶室

2、又叫退溶液凝结而成的固体物质，不论是天然还是人工合成凝胶，他们的内部都具有很多和微细的多孔网状机构，凝胶层析法常用天然凝胶是琼脂凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶，和葡萄糖凝胶，具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，起孔隙代销与被分离物质分了的大小有相似的数量级，在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只能有相应的小分子可以通过，适用于分离小物质。相反，交联度低的孔隙大，适用于分离大分子的物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装在柱子里，柱床体积称

3、为总体积，以Vt表示。实质上Vt是由Vo、Vi与Vg三部分组成，既Vt=Vi+Vg+VOoVo称为孔隙体积或者外体积，又称为外水体积，即存在于柱床内凝胶克里外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内部流动相的体积；Vi为内部体积，济宁叫颗粒内部所含水相的体积，因此Vt-Vo=Vi+Vg脱洗体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式子屮的Ve为脱水体积，自加入样品时算起，到祖坟最大浓度出现时候流出的体积，Kd为样品组分在二相间的分配系数。它只与被分离物质分了的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布冇关，与柱的长

4、短粗细无关，也就是说他对每一个物质为常数。与柱的物理条件无关。Kd可以通过实验室求得。上式子可改写成：Kd=(Ve-Vo)/Vi,Vo表示外体积；Vi内体积；Veil、Velll分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以冇下列几种情况：1、当Kd二0时，则Ve=VOo即对于根木不能进入凝胶内部的大分了物质(全排阻），洗脱体积等于空隙体积2、当Kd"时，Ve=Vo+Vio即小分了可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离

5、效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1,它们即使分子大小冇不同，也没冇分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3、当0l时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vio例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd>lo如苯丙氨酸,络氨酸和色氨酸在SephadxG-25中德Kd值分别为1.2,1.4和2.2。在实际工作中，对小分子物质也得不到

6、Kd二1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G・10型得Kd值0.75左右，用G・25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g-WR计算，为此也常冇直接用小分子物质D20,NaCI等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd,而用Kav（有效分配系数）代替Kd,其定义如下：已知Kd=Ve-VoVi,Vt-Vo代替Vi,则：Kav二Ve・Vo/Vt・Vo即Va=Vo+Kav（Vt-Vo）在这里实际上将原来

7、以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt・Vo作为固定相，而洗脱剂（Ve・Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流动Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，只一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱是，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前而。Ve与分子量的关系可用卜'式表示：Ve=KrK2logMK1与K2为常数，M为分了数，Ve也可用Ve・V。（分

8、离体积）,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt（简化的洗脱休积，它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级愈好,而工作范围愈窄。凝